Summary
Burada lekeli için bir montaj protokolü
Abstract
Birkaç iyi bilinen morfogenetik gradyanlar ve hücresel hareketler / dorsal ventral eksen boyunca meydana
Protocol
1. Görüntüleme Metodoloji
- Homojen bir sıvı hale gelene kadar 20-30 dakika boyunca 55 ° C derecede su banyosunda jöle gliserin eritin. Girdap, ancak kabarcık oluşumunu önlemek için, şişe sallamayın.
- Jöle erir iken, gliserol, temiz bir cam slayt (isteğe bağlı) bir Kimwipe kullanılarak ince bir tabaka uygulanır.
- Eritilmiş gliserin Pipet 1 ile 1,5 ml sütü slayt yüzeyde ince bir katman yaratmak için bir kesim P1000 pipet kullanarak. Kabarcıkları önlemek için dikkatli bir şekilde Pipet.
- Jöle yatay bir yüzey üzerine 5 dakika, 5 dakika sonra -20 ° C'de slayt yerleştirmek ve embriyo uyumuna devam katılaşmaya. Alternatif olarak, Saran Wrap slayt kapak ve 5 güne kadar 4 ° C'de yerleştirin.
- Pipet jöle yatak tarafında% 70 gliserol / PBS veya diğer antifade gliserol tabanlı montaj ortam (örneğin Slowfade veya Vectashield) lekeli embriyoların küçük bir damla.
- Jöle yüzeyine açılan tek tek aktararak embriyolar ön hizalama başlayın. Eğimli tarafı bir kaşık kullanarak, eğimli bir derialtı iğne kullanarak aktarabilirsiniz.
- Kabaca embriyoların 2 ile 3 sütun boyunca yerleştirin. Bir embriyo iğne takılıyor içeren diğer embriyolar serbest bırakmak için açılan karıştırın. Bu noktada dikkatli bir şekilde hizalamak zaman israf etmeyin. Sütunlar arasında biraz boşluk bırakın.
- Derialtı iğne yardımı ile jöle orta yatay sürgülü embriyolar hizalayın. Iken sürgülü, yönlendirmek, aynı yönde başları ve kuyrukları. Sütun boyunca birbirine paralel olun. Bükülmüş Kimiwipe bir parça bir iz olarak sol PBS gliserol fazla çıkarın.
Not: Fazla gliserol, iki jöle tabakalarının ayrılması zor kesilmiş ve monte etmek için, embriyolar jel içinde gevşek kaplı olması neden olacaktır. Tersine, çok gliserol kaldırarak kuru ve embriyolar dümdüz olacak. - Embriyolar (50-150 mcL kaç uyumlu hale getirilmiştir bağlı olarak) üzerinde ince bir tabaka jöle yaymak için bir kesme sarı ucu kullanın.
- Yeri -20 ° C derin dondurucuda 10-20 dakika süreyle 4 ° C gecede slayt veya depolamak. Jöle tamamen kesmeden önce sert emin olun. Aksi takdirde, embriyo blok tüketim için çok zor olacak. Kesim için en iyi sonuçları ertesi gün elde edilir.
- Diseksiyon kapsamında, jöle ile hizalanır embriyoların her iki tarafta tamamen kesmek için jilet kullanın. Jileti düz kesimler yapmak için bir 90 ° açıyla tutun. Önlemek için aşırı jöle görüntüleme engel olabilir embriyoların ön ve arka kutupları çok yakın kesimler yapılmalıdır.
- 100-200 mcL soğuk PBT (4 ° C, PBS +0.1% Tween 20) keser ve dikkatlice bir spatula ile embriyoları arasında jöle kazıyın.
Not: PBT olarak deterjan, jöle embriyoların zarar vermeden slayt çıkarılması yardımcı olur. - Bir iğne kullanarak, daha fazla kesim için temiz bir slayt gömülü embriyolar ile jöle blok transferi. 5-7 embriyolar ile küçük blokları kesin. PBT jöle blok etrafında kolayca taşımak için kullanın. Alternatif olarak, tam gerekirse, jöle kırparak için daha fazla istikrar yaratan cam, verdikleri izin vermek, kuru bir cam yüzey blok yerleştirin.
- Dik bir jilet ve bir iğne yardımı ile jöle gömülü embriyolar çevirin. Mikroskop altında görselleştirme için kullanılan standı mikroskobun tipine göre, aşağıdaki iki adım ikisinden biri ile devam edin.
- Ters mikroskop yer dik bir pozisyonda embriyolar, embriyo blokları uzun bir lamel üzerine tamamladı. Jöle en az miktarı ile embriyonun tarafına amacı ile daha yakın temas halinde olmasını sağlamak.
- Dik mikroskop: "destekler" olarak kullanılan ve "destekler" arasında gliserol embriyo blok superglue ile yapıştırılmış dört # 1 lamelleri ile iki yığınlarının olun. Uzun bir lamel kullanarak yığınları Köprüsü.
- Konfokal analizi için kullanılacak hedefleri bulmak için çalışma mesafesi kontrol görüntü embriyo ile tüm yol ya da sadece kısmen olsun. Örneğin, D. melanogaster embriyolar ~ 0.55 mm uzunluğunda ve tamamen Zeiss 20x Plan-Apo veya 40x LD Neo-Fluor amacı kullanarak görüntülü olabilir. Aşağıdaki web sitesi mevcut Zeiss hedefleri hakkında bilgi ve çalışma mesafelere göre hedefleri arama seçeneği sunar: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php
2. Temsilcisi Sonuçlar
Embriyoların değişmeden kalır, çünkü bu yöntem, embriyonun büyüklüğü ve gen ekspresyonu arasındaki mesafelerin hassas ölçümler yapmak üzere kullanılabilir. Şekil 1, biz nükleer leke DAPI (mavi), anti-Dorsal protein (kırmızı), sog mRNA (sarı) ve sna mRNA (yeşil) ile boyanmış bir blastodermin dönem embriyoların göstermektedir. Morfolojik süreçses, mezoderm invajinasyon (Şekil 2A, B) ve mezodermal hücreler (Şekil 3 ve 4) göç gibi aynı zamanda bu yöntemi kullanarak görüntülenmiştir olabilir. DV ekseni boyunca Farklı bir Z-pozisyonları Şekil 2-4 gösterildiği gibi, odak düzlemi değiştirerek elde edilebilir.
Şekil 1. Blastodermin aşamasında sağlam embriyonun Dik optik dilim mRNA ve protein çift boyama. Yerinde sondalar (sog ve SNA) ve primer antikor (anti-Dorsal) ile boyanan protein Hedef mRNA'ların rakam gösterilir. DAPI çekirdekleri etiketlemek için kullanılmıştır. Sog ve sna ifade Dorsal ifade nükleer iken, sitoplazma apikal yer olduğunu unutmayın. Çekirdekleri bulunmaktadır sog doğmakta olan transkript güçlü sinyaller de bu büyütme görülebilir.
Şekil 2. Sağlam bir gastrulating embriyo Dik görüntüleme. MRNA problar kullanılır ve kendi renkleri resimde belirtilmiştir. A) Bu aşamada, üç gen aynı Florlu (yeşil sna, sog ve DPP) ile boyandı Not mekansal olarak ayrılmış alanlar olarak ifade edilir. Invaginating mezoderm sna ifade neuroblast tabakası ind ifade ve sog ifade hala sinir sistemi ventral bölgelerinde mevcut ise ektoderm, DPP ifade eder. B) aynı embriyo konfokal daha derin bir düzlemde şiddetle sna ifade invaginating mezoderm taban notu, ancak apikal bölgenin düşük seviyelerde ifade.
Şekil 3. Salyangoz, ind ve DPP mRNA'ların (yeşil), dorsal protein (kırmızı); mikrop bant ile sağlam embriyonun Dik görüntüleme sog RNA (sarı) genişletilmiş. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Embriyonun baş yakınındaki A) Odak düzlemi. B), aynı embriyonun gövde bölgede başka bir odak düzlemli. Ventral orta hatta yakın bir mikrop-band uzatılmış embriyonun her iki tarafta yalan yanal göç önce mezodermal hücreler (Şekil 4 karşılaştırmak) Not kitle. Yaymaksızın neuroblasts yeşil (ind ve sna) etiketlenir.
Şekil 4. Dik görüntüleme germ bant uzatma süresi boyunca sağlam bir embriyo sog RNA (sarı), salyangoz, ind ve DPP mRNA'ların (yeşil), dorsal protein (kırmızı). A), epitel (ok) yaymaksızın neuroblasts Not Bu aşamada (yeşil) ind ve sna hem boyandı. Sog kısıtlı ifadesi ventral orta hat (sarı) de unutmayın . Bu aşamada DPP İfade embriyo (yıldız) lateral kenarlarında görülebilir. B) aynı embriyo Optik bölüm sonuna yakın, orta-arka bölgeye karşılık gelen embriyo uzunluğu, A gösterilir. Ventral orta hat hücreleri sog lekeli.
Discussion
Dilimleri 2 veya genellikle floresan renklendirmeler için zararlı mikrotom işleme, gömülü medya kullanımı ya dikkatli bir yandan diseksiyonu gerektirir beri Drosophila embriyoların kesit görüntüleri almak zor olabilir. Alternatif olarak, Z-Konfokal mikroskop yapılan yığınları kesit görüntülerin 3 boyutlu rekonstrüksiyon yapmak için kullanılabilir. Ancak, doğru bir 3 boyutlu rekonstrüksiyon ve photobleaching sorunlu olur, birkaç ince Konfokal dilim yapmak için zaman alıcı. Boylamasına monte edilmiş görüntüleme embriyolar, aynı zamanda, protein ya da mRNA seviyeleri 1 ölçümü amacıyla floresan sinyallerin hassas ölçümler alarak karmaşıklaştırır embriyo, daha derin bölümleri ulaşıldığında meydana gelen ışık saçılması başka endişe konusu. Hatta bir iki foton konfokal mikroskop, ışık saçılması hala sınırlı olmak üzere en iyi örnek şeffaflık için montaj medya seçimi yapar embriyo, ortasında sarısı malzeme opaklık nedeniyle bir konudur.
Bu sorunları aşmak için, dikey konumlandırma embriyoların "End" görüntüleme adı verilen yeni bir tekniği son 4 canlı ve sabit örnekleri görüntü için geliştirilmiştir . Bu çalışmada, biz yerinde sondalar 3 birden fazla lekeli herhangi bir boyut ve şekil sabit embriyolar veya dokular basit bir hazırlık ve görselleştirme sağlayan dikey olarak monte edilen embriyolar için yeni bir protokol geliştirmiştir. Bizim yöntemi jelatinimsi bir tutarlılık içinde uyumlu embriyoların kaplamak için kullanılır montaj medya kullanılarak oluşur. Konfokal mikroskop her türlü görüntüleme önce gömülü embriyoları içeren bu montaj medya kesme taş blokların dik olarak konumlandırılmış olabilir.
Embriyoların jöle içine gömme ve dikey olarak konumlandırma, embriyonun dorsal-ventral eksen boyunca hücreler aynı anda sunulduğu mikroskopisi kullanılarak yatay kesitler almak mümkün. Bu ışık saçılması ve boylamasına monte edilmiş embriyolar geleneksel Z-yığın yeniden yapılanma oluşur floresan boyaların photobleaching artık ortadan kalkar sorunları beri kantifikasyon amaçlar için önemli bir gelişme. Dorsal-ventral zıt pozisyonlarda bulunan hücreler aynı anda ve aynı konfokal Z-pozisyon imaged Böylece, dorsal-ventral eksen boyunca gen ekspresyonu veya protein düzeylerinin ölçümü, doğru. Buna ek olarak, açıklanan yöntem bize DV 6 eksen boyunca farklı pozisyonlarda hücreleri görselleştirmek için karmaşık hesaplama unrolling yöntemleri kullanmadan, 3-D bir embriyonun dorsal-ventral eksen boyunca tam bir 2-D görüntü elde etmesini sağlar.
Bazı kritik adımlar, iki tabaka jöle arasında bölünmüş önlemek için, embriyolar hizaladıktan sonra aşırı gliserol kaldırarak içerir. Ancak, örnek çok susuz ise, elde edilen görüntü şekilsiz olabilir ve yanlış morfoloji var. Buna ek olarak, embriyonun çevresindeki jöle orta yerine düz bir açıyla kesilmiş ise, ortaya çıkan görüntü, 90 derece dışında bir açıyla embriyoların yanlış bir konumlandırma şekli nedeniyle, daha yuvarlak ve daha fazla yumurta görünebilir. Son olarak, jöle, ön / arka ucunda embriyonun yeterince yakından kesmek değilse, amacı, çalışma mesafesi esas jöle ve embriyo içine odaklanmak için kullanılır, çünkü uygun bir görüntü elde etmek mümkün değildir.
Önemli bir adım daha görüntüleme geç gastrulating embriyo hizalayarak önce dikkatlice kapsamında ilgi aşamaları sıralamak için zaman gerekli olabilir. Genellikle uzunlamasına bir pozisyonda en kolay kabul edilebilir morfolojik özelliklerine göre, embriyolar sahnelenir.
Bu yöntem ile yapılabilir alternatif değişiklikler arasında, bir anti-solmaya reaktifi (örneğin, p-Phenylenediamine'nin veya PPD), floresan boya photobleaching karşı korunmasına yardımcı, jöle, ikinci katmanı içine dahil etmektir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar Deborah Harris ve Danielle MacKay özellikle borçlu. Bu iş için destek ve CWRU Sanat ve Sosyal Bilimler Fakültesi Biyoloji Bölümü tarafından sağlanan ve biyolojik bilimler alanında lisans eğitimi desteklemek için HHMI hibe numarası 52005866.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerin Jelly mounting media | Electron Microscopy Sciences | 17998-10 | Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997. |
| Zeiss LSM 700 Confocal | Carl Zeiss, Inc. | The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm). | |
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT) | |||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Glass cover slips | Electron Microscopy Sciences | 72204-02 | Size 1 ½ (specific for the objectives used in this work). |
| Glass cover slips (for making supports) | Fisher Scientific | 12-544-10 | Use four coverslips glued with superglue. |
| Dissection microscope | M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop | M420 | |
| Razor blade | Steel back single edge industrial blades | ||
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Hypodermic needles | Fisher Scientific | 1482610 | 26 Gauge |
| Pipettes | Labnet International |
References
- Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos. Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).
- Grβhans, J., Wieschaus, E. A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila. Cell. 101, 523-531 (2000).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).
- Zander, R. H. On mounting delicate bryophytes in glycerol. The Bryologist. 100, 380-382 (1997).
- Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).
