डेंगू संक्रमण के लिए मच्छरों (ए aegypti) और संक्रमण Phenotype निर्धारण में प्रोटोकॉल

Summary

एक बार एक जीन संभावित डेंगू वायरस के लिए आग रोक के रूप में पहचान की है, यह मच्छर के भीतर वायरल संक्रमण रोकने में यह भूमिका के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल दिखाता है कि कैसे मच्छरों के डेंगू संक्रमण की हद तक assayed किया जा सकता है. संस्कृति, झिल्ली खिला मच्छरों मानव रक्त में वायरस बढ़ रही है, और मच्छर midgut में वायरल titers परख करने की क्रिया के लिए तकनीक का प्रदर्शन कर रहे हैं.

Abstract

इस प्रक्रिया के उद्देश्य से डेंगू वायरस के साथ एक प्रयोगशाला हालत में एडीज मच्छर संक्रमित मच्छर के ऊतकों में संक्रमण और वायरस का गतिशील स्तर की जांच करने के लिए है. इस प्रोटोकॉल नियमित रूप से मच्छर वायरस बातचीत उपन्यास मेजबान कारकों है कि सदिश क्षमता निर्धारित करने में सक्षम हैं की पहचान के लिए विशेष रूप से, अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है. पूरे प्रयोग एक BSL2 प्रयोगशाला में आयोजित किया जाना चाहिए. प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम संक्रमण के लिए इसी प्रकार, दस्ताने और प्रयोगशाला कोट सहित उचित पोशाक हर समय पहना होना चाहिए. प्रयोग के बाद, सभी सामग्री है कि वायरस के संपर्क में आया के लिए 75% और सामान्य धोने के साथ आगे बढ़ने से पहले इथेनॉल प्रक्षालित के साथ इलाज किया जा जरूरत है. अन्य सभी सामग्री के लिए उन्हें discarding पहले autoclaved की जरूरत है.

Protocol

C6/36 सेल लाइन में वायरस का प्रचार. कक्ष 80 75 2 सेमी फ्लास्क में confluency% बढ़ने; 3-4 कुप्पी में शेष मिलीलीटर के साथ मीडिया निकालें; 0.5 मिलीलीटर शेयर वायरस ले लो और सेल प्रति 1.5 वायरस कणों के संक्रमण की बहुलता के साथ ऊपर के कक्ष में जोड़. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीरे धीरे कुप्पी हिलती. 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए सेते 30 मिलीलीटर मीडिया जोड़ें, और 5 दिनों के लिए सेते हैं. बी वायरस और रक्त के मिश्रण तैयार खुरचनी के साथ सेल अलग और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों के लिए सेल और मीडिया हस्तांतरण; 10 मिनट के लिए 800g पर Centrifugate, सतह पर तैरनेवाला जमा है, लेकिन सेल गोली के साथ सतह पर तैरनेवाला के 1ml छोड़; सूखी सीओ 2 में ऊपर सेल गोली रुक और फिर 37 डिग्री सेल्सियस जल स्नान, दोहराने दो से तीन बार में गल; 10 मिनट के लिए 800g पर Centrifugate, सतह पर तैरनेवाला ले, और चरण 3 से एकत्र की सतह पर तैरनेवाला के साथ गठबंधन; प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम के साथ एनोफ़ेलीज़ मच्छर संक्रमित gametocyte संस्कृति की तैयारी के लिए एक ही प्रक्रिया (कदम 3) के साथ पूरे मानव रक्त ले लीजिए; ऊपर चरण 4 से वायरस सतह पर तैरनेवाला के साथ पूरे मानव रक्त के बराबर राशि का मिश्रण है, और मानव सीरम जोड़ने (पूरी मात्रा का 10%). 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर 30 मिनट के लिए मानव रक्त और डेंगू वायरस के ऊपर मिश्रण सेते सी. दूध पिलाने मच्छरों यह प्रक्रिया लगभग मच्छरों में प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम संक्रमण के लिए अनुभाग में वर्णित किया गया है समान है . 7 दिन में हम midgut संक्रमण परख, और रक्त भोजन के बाद 14 दिन में लार संक्रमण. सभी सामग्री है कि वायरस के संपर्क में आया था पहले तो 75% इथेनॉल के साथ और 10% ब्लीच के साथ व्यवहार कर रहे हैं. डी. मच्छर के ऊतकों में वायरस टिटर परख मच्छर ऊतक के विच्छेदन के पहले दो या तीन दिनों एक 24 अच्छी तरह से ऐसी है कि सेल दिन जब परख आयोजित किया जाता है पर 80 confluency% तक पहुंचने की थाली में C6/36 सेल बढ़ने; मच्छरों 4 में anesthetized हैं डिग्री सेल्सियस, बलिदान और 75% इथेनॉल में उन्हें 1 मिनट के लिए भिगोने द्वारा बाँझ सामने. फिर मच्छरों बाँझ पानी से धोया गया midgut या लार ग्रंथि के विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत विच्छेदन से पहले दो बार. इस कदम से सभी नीचे प्रक्रिया के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के रूप में एक बाँझ वातावरण में आयोजित होने की जरूरत है. इन ऊतकों 150 μl मीडिया युक्त ट्यूब स्थानांतरित कर रहे हैं और एक Kontes 90 सेकंड के लिए गोली मूसल मोटर साथ homogenized हैं; Homogenate के 990 μl मीडिया में 10 μl जोड़कर 1:100 कमजोर पड़ने बनाओ; आगे एक बनाओ: 10, 1:100 और 96 अच्छी तरह से थाली में मध्यम के साथ 1:1000 कमजोर पड़ने; 24 अच्छी तरह से थाली में मीडिया निकालें, और प्रत्येक इसी अच्छी तरह से ऊपर चार dilutions के प्रत्येक के 100 μl जोड़ने; थाली कमरे के तापमान पर 15 मिनट, तो 5% से कम 45 मिनट के लिए सेते के लिए धीरे – धीरे हिलाएँ सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस ; एक अच्छी तरह से methycellulose उपरिशायी (1%) के 1ml जोड़ें; 37 में प्लेटें सेते ° सी 5 दिनों के लिए 5% सीओ 2 के साथ ; यहाँ से कदम एक बाँझ वातावरण की आवश्यकता नहीं होती, लेकिन किसी भी अन्य रोगज़नक़ देखभाल के साथ के रूप में सभी समय पर लिया जाना चाहिए. प्रत्येक थाली से methycellulose उपरिशायी त्यागें और अतिरिक्त मीडिया को हटाने के लिए दाग प्रत्येक अच्छी तरह / मेथनॉल एसीटोन लगानेवाला (1:1) के 1ml जोड़ें. 1 घंटे के लिए 4 ° C में रखें; बंद लगानेवाला डालो, और 1X पीबीएस के साथ एक बार धो; मदहोश 5% के साथ वायरस के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी 1:1000 कमजोर पड़ने बनाओ; 1 घंटे के लिए प्रत्येक 37 में अच्छी तरह से, सेते ° सी पतला hyperimmune तरल पदार्थ के 200 μl जोड़ें; 1 एक्स पीबीएस के साथ hyperimmune तरल पदार्थ और धोने की थाली निकालें 5% मदहोश (1 एक्स पीबीएस के 100 मिलीलीटर में 5g पाउडर मलाई निकाला दूध) में बकरी संयुग्म विरोधी माउस के एक 1:1000 कमजोर पड़ने (KPL बिल्ली # 074-1806) तैयार है, और फिर एक अच्छी तरह से 200 μl जोड़ने, और सेते 1 घंटे के लिए 37 ° सी; सब्सट्रेट के रूप में तैयार: 1 एक्स पीबीएस के 20 मिलीलीटर में 1 3'-Diaminobenzidine terrahydrochloride गोली (सिग्मा बिल्ली # D5905) जोड़ने के बाद भंग, और फिर 30% हाइड्रोजन peroxidase के 8 μl जोड़ने प्रत्येक अच्छी तरह से ऊपर सब्सट्रेट के 200 μl जोड़ें. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े चलो सब्सट्रेट निकालें और एक अच्छी तरह से आसुत जल के 1ml जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकने के बंद पानी और दाग प्लेटें डालो करने के लिए सूखी वायरस कण गिनती

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Incubator				with 5% CO2, 37oC
50 mL conical tubes				plastic
human serum and blood				O+
pipette tip				for tissue culture
pipettman
Pasteur pipetts				glass, sterile
water bath				37C
centrifuge
parafilm
circulating water bath
glass membrane feeders				with rubber tubing to fit feeders
mosquito cups
75% ethanol
10% bleach
Tissue-culture plates				6-well, 24-well and 96-well plates
Petri dish				glass
Slides
fine-tip forceps
PBS				1X, sterile
dissecting microscope	Microscope
C6/36 cells	cells			For virus propagation
C6/36 medium				MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride		Sigma	D5905	1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 µl of 30% hydrogen peroxidase
30% hydrogen peroxidase
A. aegypti	Animal			mosquito