Una volta che un gene è identificato come potenzialmente refrattaria per il virus della dengue, deve essere valutato per il suo ruolo nella prevenzione delle infezioni virali all'interno della zanzara. Questo protocollo illustra come il grado di dengue di zanzare possono essere analizzati. Le tecniche per crescere il virus in coltura, l'alimentazione a membrana zanzare sangue umano, e saggio titoli virale nel midgut zanzara sono dimostrati.
Lo scopo di questa procedura è per infettare la zanzara Aedes con il virus della dengue in una condizione di laboratorio ed esaminare il livello di infezione e dinamica del virus nei tessuti zanzara. Questo protocollo è utilizzato di routine per lo studio delle interazioni virus zanzare, in particolare per l'identificazione dei fattori dell'ospite romanzo che sono in grado di determinare la competenza vettoriale. L'intero esperimento deve essere condotto in un laboratorio BSL2. Simile a infezioni Plasmodium falciparum, abbigliamento adeguato compresi i guanti e camice da laboratorio devono essere indossati in ogni momento. Dopo l'esperimento, tutti i materiali che è venuto a contatto con il virus devono essere trattati con il 75% di etanolo e sbiancato prima di procedere con il normale lavaggio. Tutti gli altri materiali devono essere sterilizzati in autoclave prima di eliminarli.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Incubator | with 5% CO2, 37oC | |||
50 mL conical tubes | plastic | |||
human serum and blood | O+ | |||
pipette tip | for tissue culture | |||
pipettman | ||||
Pasteur pipetts | glass, sterile | |||
water bath | 37C | |||
centrifuge | ||||
parafilm | ||||
circulating water bath | ||||
glass membrane feeders | with rubber tubing to fit feeders | |||
mosquito cups | ||||
75% ethanol | ||||
10% bleach | ||||
Tissue-culture plates | 6-well, 24-well and 96-well plates | |||
Petri dish | glass | |||
Slides | ||||
fine-tip forceps | ||||
PBS | 1X, sterile | |||
dissecting microscope | Microscope | |||
C6/36 cells | cells | For virus propagation | ||
C6/36 medium | MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin. | |||
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride | Sigma | D5905 | 1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 µl of 30% hydrogen peroxidase | |
30% hydrogen peroxidase | ||||
A. aegypti | Animal | mosquito |