När en gen har identifierats som potentiellt eldfasta för denguefeber virus, måste det utvärderas för sin roll för att förebygga virusinfektioner inom mygga. Detta protokoll visar hur omfattningen av denguefeber infektioner av myggor kan analyseras. De tekniker för att odla fram viruset i kulturen, membran utfodring myggor blod, och testmetoder för virus titer i myggans midgut demonstreras.
Syftet med detta förfarande är att infektera Aedes mygga med denguefeber virus i ett laboratorium skick och undersöka infektionen nivån och dynamiska av viruset i mygga vävnader. Detta protokoll används rutinmässigt för att studera mygga-virus interaktioner, särskilt för identifiering av faktorer roman värd som skall kunna avgöra vektor kompetens. Hela experimentet måste utföras i en BSL2 laboratorium. I likhet med Plasmodium falciparum infektioner, måste korrekt klädsel, inklusive handskar och laboratorierock användas vid alla tillfällen. Efter experimentet, allt material som kom i kontakt med viruset måste behandlas med 75% etanol och blekt innan du fortsätter med vanlig tvätt. Alla andra material måste autoklaveras innan kasta dem.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Incubator | with 5% CO2, 37oC | |||
50 mL conical tubes | plastic | |||
human serum and blood | O+ | |||
pipette tip | for tissue culture | |||
pipettman | ||||
Pasteur pipetts | glass, sterile | |||
water bath | 37C | |||
centrifuge | ||||
parafilm | ||||
circulating water bath | ||||
glass membrane feeders | with rubber tubing to fit feeders | |||
mosquito cups | ||||
75% ethanol | ||||
10% bleach | ||||
Tissue-culture plates | 6-well, 24-well and 96-well plates | |||
Petri dish | glass | |||
Slides | ||||
fine-tip forceps | ||||
PBS | 1X, sterile | |||
dissecting microscope | Microscope | |||
C6/36 cells | cells | For virus propagation | ||
C6/36 medium | MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin. | |||
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride | Sigma | D5905 | 1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 µl of 30% hydrogen peroxidase | |
30% hydrogen peroxidase | ||||
A. aegypti | Animal | mosquito |