Bestimmen Zellzahl während der Zellkultur mit dem Scepter Cell Counter

Summary

Das Zepter Cell Counter ist ein Handheld-Gerät, das automatisierte verwendet, um Zellen zu zählen, überwachen Zelldurchmesser und Volumen, und verwendet, um die Gesundheit und Lebensqualität von Zellpopulationen von einer Kultur zur nächsten Überprüfung werden können.

Abstract

Zählen von Zellen ist häufig eine notwendige, aber lästige Schritt für In-vitro-Zellkultur. Konsequente Zellkonzentrationen sicherzustellen experimentelle Reproduzierbarkeit und Genauigkeit. Die Zellzahlen sind wichtig für die Überwachung der Zelle Gesundheits-und Proliferationsrate, die Beurteilung Immortalisierung oder Transformation, säen die Zellen für nachfolgende Experimente, die Transfektion oder Infektion, und die Vorbereitung für die Zell-basierte Assays. Es ist wichtig, dass Zellzahlen präzise, ​​konsistente und schnell sein, besonders für die quantitative Messung der zellulären Reaktionen.

Trotz dieses Bedürfnis nach Schnelligkeit und Genauigkeit in Zellzählung, befragten 71% von 400 Forschern ^1, die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer zählen. Während hemocytometry ist billig, es ist mühsam und unter user bias und Missbrauch, die zu ungenauen Ergebnissen zählt. Hemocytometers sind aus optischem Spezialglas, auf dem Zellsuspensionen in bestimmten Mengen verladen werden und gezählt unter dem Mikroskop gemacht. Fehlerquellen in hemocytometry gehören: unebene Zelle in der Probe, zu viele oder zu wenige Zellen in der Probe, subjektive Entscheidungen, ob eine bestimmte Zelle innerhalb der definierten Zählen Bereich fällt, eine Kontamination der Zählkammer, User-to-User-Variante und Variation der Zählkammer Füllrate ^2.

Zur Linderung der Langeweile mit manuellen Zählung verbunden sind, zählen 29% der Forscher Zellen mit Hilfe von automatisierten Zellzählung Geräte, dazu gehören Vision-basierte Zähler, Systeme, die Zellen unter Verwendung des Coulter Prinzip erkennen oder Durchflusszytometrie ^1. Für die meisten Forscher ist das Haupthindernis für über ein automatisiertes System den Preis mit diesen großen Tischgeräten ¹ zugeordnet.

Das Zepter cell counter ist ein automatisiertes Handheld-Gerät, dass die Automatisierung und die Genauigkeit der Coulter Zählung bei relativ geringen Kosten bietet. Das System nutzt die Coulter Prinzip der Impedanz-basierten Teilchennachweis ³ in einem miniaturisierten Format mit einer Kombination aus analogen und digitalen Hardware zur Erfassung, Signalverarbeitung, Datenspeicherung und grafische Darstellung. Die Einweg-Spitze wird mit einer mikrostrukturierten, Zell-sensing-Zone, dass die Diskriminierung von Zellgröße und Zellvolumen bei sub-Mikrometer-und Sub-Picoliter-Auflösung ermöglicht entwickelt. Angereichert mit Präzision Liquid-Handling-Kanäle und Elektronik, berichtet das Zepter Zellzähler Zellpopulation Statistiken grafisch als Histogramm angezeigt.

Protocol

1. Die Bedeutung der Zellzählung

1. Zählen von Zellen ist eine notwendige, aber lästige Schritt für In-vitro-Zellkultur.
2. Konsequente Zellkonzentrationen sicherzustellen experimentelle Reproduzierbarkeit und Genauigkeit.
3. Die Zellzahlen sind wichtig für die Überwachung der Zelle Gesundheits-und Proliferationsrate, die Beurteilung Immortalisierung oder Transformation, säen die Zellen für nachfolgende Experimente, die Transfektion oder Infektion, und die Vorbereitung für die Zell-basierte Assays.
4. Trotz der Notwendigkeit einer Geschwindigkeit und Genauigkeit in Zellzählung,, 71% von 400 befragten Forscher zählen Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. Während hemocytometry ist billig, es ist mühsam und unter user bias und Missbrauch, die zu ungenauen Ergebnissen zählt.
5. Fehlerquellen in hemocytometry gehören: unebene Zelle in der Probe, zu viele oder zu wenige Zellen in der Probe, subjektive Entscheidungen, ob eine bestimmte Zelle innerhalb der definierten Zählen Bereich fällt, eine Kontamination der Zählkammer, User-to-User-Variante und Variation der Zählkammer Füllrate.
6. Zur Linderung der Langeweile mit manuellen Zählung verbunden sind, zählen 29% der Forscher Zellen mit Hilfe von automatisierten Zellzählung Geräte. Doch für die meisten Forscher, ist der Preis, mit diesen großen Tisch-Instrumenten verbundenen ein Hindernis für ihre Verwendung.
7. Das Zepter cell counter ist ein automatisiertes Handheld-Gerät, dass die Automatisierung und die Genauigkeit der Coulter Zählung bei relativ geringen Kosten bietet.
8. Das System nutzt die Coulter Prinzip der Impedanz-basierten Teilchennachweis in einem miniaturisierten Format mit einer Kombination aus analogen und digitalen Hardware zur Erfassung, Signalverarbeitung, Datenspeicherung und grafische Darstellung.
9. Der Einweg-Sensor ist mit einem mikrostrukturierten, Zell-sensing-Zone, dass die Diskriminierung von Zellgröße und Zellvolumen bei sub-Mikrometer-und Sub-Picoliter-Auflösung ermöglicht entwickelt.
10. Angereichert mit Präzision Liquid-Handling-Kanäle und Elektronik, das Zepter Zellzähler grafisch Zelle Bevölkerungsstatistik als Histogramm.

2. Erstellung eines Single-Zell-Suspension für Counting

1. So verwenden Sie das Zepter Zellzahl, die durch Verdünnen einer Zellsuspension von Zellen beginnen, in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Eine Konzentration von 10,000-500,000 Zellen pro ml ist optimal.
2. Transfer 100 ul der verdünnten Zellen zu einer 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.

3. Performing Zellzahlen mit dem Scepter

1. Schalten Sie das Zepter Zellzahl durch Drücken und Halten der Kipphebel an der Rückseite des Gerätes und warten auf die Anweisungen auf dem Bildschirm zu erscheinen.
2. Wenn Sie aufgefordert werden, legen einen Sensor, um das Ende der Szepter Einheit mit der Elektrode sensing Panel zugewandten Vorderseite des Gerätes.
3. Scepter Sensoren bestehen aus einer präzisionsgepresste Messkammer, mit einem elektronischen Schutzfeld und integrierten Zell-Sensing-Elektroden. Die Sensoren machen es möglich, Zellgröße bei Submikrometerauflösung diskriminieren und Zellvolumen bei sub-Picoliter-Auflösung.
4. Konsequente Sensorik, sorgt dafür, dass gleich Probenvolumina gezählt werden und genaue Größe Messungen vorgenommen werden.
5. Sobald der Sensor angebracht ist, führen Sie jeden Schritt der Zählvorgang nach den Anweisungen auf dem Bildschirm wie folgt:
6. Wenn auf dem Bildschirm liest "Halten Sie den Kolben zu beginnen", drücken Sie den Kolben. Der Bildschirm wird dann zu lesen "tauchen den Sensor." Tauchen Sie den Sensor in die Zellsuspension Lösung und lassen Sie die Kolben, um die Zellsuspension in den Sensor absaugen.
7. Der Kolben dient als ein elektrisches Signal und wird die Probe plus Totvolumen in den Sensor zu ziehen. Die Geschwindigkeit und Genauigkeit zu stürzen spielt keine Rolle, wie es mit Pipettieren tut. Dieser Prozess wird einige Sekunden dauern. Wenn Sie fertig sind, wird das Instrument Signalton und "Sample geladen" wird auf dem Bildschirm angezeigt werden.
8. Nachdem die Probe in den Sensor es durch das Schutzfeld gezogen wird, um Zellgröße und Zellvolumen zu beurteilen, dann durch die Mikrokanäle geladen. Nach 50 ul Probe zählte die Sensor teilt dem Instrument, um aufhören zu zählen.
9. Nach der Zählung abgeschlossen ist, wird das Instrument auf den Bildschirm zu lesen "Count Complete. Bitte entfernen Sie Sensor und zu verwerfen." Befolgen Sie die Eingabeaufforderung, und entfernen und entsorgen Sie den Sensor.
10. Das Gerät zeigt dann ein Histogramm der Zellgröße oder Durchmesser auf dem Bildschirm sowie die Zellkonzentration pro mL.

4. Data Analysis

1. Nach der Zählung abgeschlossen ist und das Histogramm auf dem Instrument angezeigt, gelten Toren, indem Sie die Schaltfläche mit Umschaltfunktion. Wählen Sie "auto Gating" oder "Verwendung letzten" entweder automatisch das Tor auf das Histogramm-Profil basiert, oder bis vor die Tore der letzten Zählung verwenden.
2. Unabhängig von der Auswahl, kann das Tor manuell auf die Feinabstimmung der Daten bewegt werden. Drücken Sie die Schaltfläche mit Umschaltfunktion wieder auf der linken Tor markieren und scrollen zuggle das Tor zu bewegen, wie gewünscht.
3. Dann drücken Sie die Schaltfläche erneut, um die richtige Tor zu aktivieren und blättern Sie auf die Schaltfläche auf der rechten Tor statt. Klicken Sie erneut auf, eine neue Zellkonzentration, durchschnittliche Zellvolumen und Durchmesser wird angezeigt.
4. Das Umschalten kann auch auf beiden Seiten bewegt werden, um die Anzeige zwischen Tag-Schalter, Zeit, mittlere Zellgröße und mittlere Zellvolumen.
5. Bis zu 72 Histogramme können auf dem Gerät selbst gespeichert werden. Zum Hochladen der Daten auf einen PC, schließen Sie das Gerät über das USB-Kabel-Anschluss auf dem Bildschirm.
6. Auf dem PC, doppelklicken Sie auf das Zepter Software-Anwendung, um die Software starten Sie dann auf "connect". Alle zählt automatisch in die Software-Port.
7. Das Zepter Application Software zeigt das Histogramm detailliert die Verteilung der Bevölkerung der Kultur in entweder Volumen oder Durchmesser. Heruntergeladene Dateien können dann in Microsoft Excel, wo die Rohdaten in Behältern von spezifizierten Zelldurchmesser oder Zellvolumina angezeigt werden exportiert werden.

5. Repräsentative Ergebnisse

1. Neunzehn verschiedene Zelllinien wurden für die Zählung vorbereitet und theoretische Ausgangspunkt Konzentrationen wurden mit einem Coulter Counter. Diese Zellsuspensionen wurden dann weiter verdünnt, um Zellsuspensionen auf theoretische Zelle Konzentrationen zu erhalten.
2. Das Zepter Zellzahl wurde dann zur Zelle Konzentrationen zu bestimmen. Abbildung 1 zeigt die 5 Verdünnungen, die für 5 repräsentative Zelllinien zusammen mit den theoretischen Zellkonzentration gemessen wurden.
3. Die hohe Linearität durch die R2-Werte angegeben, zeigt, dass Scepter das Zählen ist eine zuverlässige Methode für die Zelllinien getestet, über einen weiten linearen Arbeitsbereich.
4. Die relative Genauigkeit der Scepter Zählen ist in Abbildung 2, in denen Daten aus Scepter Zählen erhalten mit Zählungen von Coulter Counting verglichen werden aufgezeigt.
5. Das Protokoll der Scepter Zellzahl ist gegen den log der Coulter zählt aufgetragen, und zeigt, dass in allen getesteten Zelllinien, match Scepter zählt Coulter zählt.
6. Grafen von 19 Zell-Linien wurden mit einem Coulter Counter Z2, das Zepter Zellzahl, eine automatisierte Vision-basierte Zähler wie Vi-Cell oder Unzählige System und eine hemocytemeter.
7. Counts wurden nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, unter Verwendung der gleichen Zelle Ausgangs-Suspension und identischen Verdünnungen. Die Ergebnisse in Abbildung 3 dargestellt zeigen, dass die Zellkonzentration von Scepter Zählen ehesten entsprechen theoretischen Zellkonzentrationen mit hoher Linearität gemessen.
8. Der prozentuale Variationskoeffizient oder CV, wurde für jede Verdünnung von jeder Zelllinie für jeden Zählsystem berechnet. Abbildung 4 zeigt die durchschnittliche% CVs über 19 Zelllinien, die mit Bezug auf die Zellkonzentration und Zählweise.
9. Innerhalb der Reichweite, wird das Zepter Zellzähler genauer als Vision basiert Zählkammer gezählt, die kleinere Standardabweichungen und kleineren mittleren Variationskoeffizienten.
10. Scepter Zählen ist zehnmal schneller als hemocytometry und schneller als andere automatisierte Zähler zu. In Abbildung 5, SF9, MCF7 und HEK293-Zellen wurden gezählt unter Verwendung der Methoden in diesem Video beschrieben.
11. Die durchschnittliche Zeit für die Zellkonzentration zu messen, wurde aufgezeichnet. Beachten Sie, dass hemocytometry nur einmal wurde pro Probe durchgeführt.
12. Scepter macht Messungen an Zellgröße basiert. Dadurch entfallen jegliche Änderungen in der Zellmorphologie kann im Histogramm erfasst werden. Gesunde Kulturen zeigen eine schöne glockenförmige Gauss-Verteilung, während ungesunde Zellen zu lysieren und zu einer Verschiebung in das Histogramm auf der linken Seite (Abb. 6, links).
13. Ebenso, wenn eine Bevölkerung von 50% tote Zellen mit 50% lebenden Zellen wurden gemischt, wurden Histogramm Verschiebungen beobachtet (Abbildung 6, rechts).

Discussion

Vergleicht man die Leistung der Scepter Zellzähler den Ergebnissen aus anderen Zählverfahren, folgern wir, dass dieser neue Handheld, automatisierte Zellzähler präzise, ​​schnelle und zuverlässige Zellzahlen liefert über einen weiten Betriebsbereich. Die Funktionalität der Scepter Zählen ist ein Ergebnis der feinmechanischen Technik in die Spitze des Sensors und die ausgefeilte Instrumentierung zählen auf die Coulter-Prinzip verankert. Die Qualität der Leistung schlägt Scepter Zählen als Methode, um die Geschwindigkeit zu erhöhen und zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Zell-basierte Assays. Die Handheld-Format ermöglicht eine schnelle Langeweile freien Zählen direkt an der Zellkultur Kapuze.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter with 40 μm Scepter Sensors	EMD Millipore	PHCC20040
Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter with 60 μm Scepter Sensors	EMD Millipore	PHCC20060
Scepter Sensors, 60 μm	EMD Millipore	PHCC60050	50 Pack of sensors
Scepter Sensors, 40 μm	EMD Millipore	PHCC40050	50 Pack of sensors
Universal Power Adapter	EMD Millipore	PHCCPOWER
Scepter O-Ring Kit	EMD Millipore	PHCCOCLIP	2 O-rings and one filter cover