Summary
샙터 셀 카운터, 세포를 카운트 세포 직경과 볼륨을 모니터링 한 문화에서 다음 세포 인구의 건강과 품질을 검사하는 데 사용하는 데 사용할 수있는 휴대용 자동 장치입니다.
Abstract
세포를 계산하는 것은 자주 체외 세포 문화에 대한 필요하지만 지루한 단계입니다. 일관된 세포 농도는 실험 재현성과 정확성을 보장합니다. 셀 카운트는 후속 실험, transfection 또는 감염 세포를 심는 불멸화 또는 변환을 평가, 세포 건강과 확산 속도를 모니터링하고, 셀 기반의 assays를위한 준비 중요합니다. 셀 카운트 특히 세포 반응의 양적 측정, 정확한 일관성 및 빠른 것이 중요합니다.
셀 카운팅의 속도와 정확성이 필요에도 불구하고, 400 연구자의 71 %는 hemocytometer를 사용하여 세포를 카운트 1 조사. hemocytometry 저렴한지만, 그것은 힘드는과 부정 확한 계산 결과를 사용자의 바이어스 및 남용에 적용됩니다. Hemocytometers는 셀 suspensions가 지정된 볼륨에로드하고 현미경으로 집계하고있는 특수 광학 유리로 만들어진 있습니다. hemocytometry에서 오류의 소스는 다음과 같습니다 : 예제에서 고르지 세포 배포 예제에서 너무 많은 혹은 너무 적은 세포, 특정 세포가 정의된 계산 영역에 속하는 것인 지에 대한 주관적인 의사 결정, hemocytometer의 오염, 사용자에게 사용자의 변화를 그리고 hemocytometer의 변형 속도 2 작성.
수동 계산과 관련된 지겨움을 완화하기 위해, 연구자의 29 %가 장치를 계산 자동 세포를 사용하여 세포를 포함, 이들은 비전 기반 카운터, 쿨터 원리를 사용하여 세포를 감지 시스템, 또는 유동세포계측법 1 포함됩니다. 대부분의 연구자 들어, 자동화된 시스템을 사용하는 주요 장벽이 큰 benchtop 악기 하나와 관련된 가격입니다.
샙터 전지 카운터는 상대적으로 낮은 비용으로 자동화 및 쿨터 계산의 정확도를 제공하는 자동화된 휴대용 장치입니다. 시스템은 쿨터 감지를위한 아날로그 및 디지털 하드웨어의 조합을 사용하여 소형 형식으로 임피던스 기반의 입자 검출 3 원칙, 신호 처리, 데이터 스토리지 및 그래픽 디스플레이를 고용합니다. 일회용 팁은 세포의 크기와 서브 마이크론과 하위 picoliter 해상도에서 셀 볼륨에 의해 차별을 가능하게 microfabricated, 셀 감지 영역에 설계되었습니다. 정밀 액체 처리 채널과 전자와 향상된, 샙터 전지 카운터 그래픽 히스토그램으로 표시 셀 인구 통계를보고합니다.
Protocol
1. 셀 카운팅의 중요성
- 카운팅 세포는 체외 세포 문화에 대한 필요하지만 지루한 단계입니다.
- 일관된 세포 농도는 실험 재현성과 정확성을 보장합니다.
- 셀 카운트는 후속 실험, transfection 또는 감염 세포를 심는 불멸화 또는 변환을 평가, 세포 건강과 확산 속도를 모니터링하고, 셀 기반의 assays를위한 준비 중요합니다.
- 에도 불구하고 셀 카운팅의 속도 및 정확도의 필요성, hemocytometer를 사용하여 카운트 세포를 조사 400 연구자의 71 %. hemocytometry 저렴한지만, 그것은 힘드는과 부정 확한 계산 결과를 사용자의 바이어스 및 남용에 적용됩니다.
- hemocytometry에서 오류 소스는 다음과 같습니다 : 예제에서 고르지 세포 배포 예제에서 너무 많은 혹은 너무 적은 세포, 특정 세포가 정의된 계산 영역에 속하는 것인 지에 대한 주관적인 의사 결정, hemocytometer의 오염, 사용자에게 사용자의 변화를 hemocytometer 충전 속도, 그리고 변화.
- 수동 계산과 관련된 지겨움을 완화하기 위해, 연구자의 29 %가 자동으로 세포 계수 장치를 사용하여 셀을 계산합니다. 그러나 대부분의 연구원이 큰 벤치 - 최고의 악기와 관련된 가격은 그들이 사용하는 장벽이다.
- 샙터 전지 카운터는 상대적으로 낮은 비용으로 자동화 및 쿨터 계산의 정확도를 제공하는 자동화된 휴대용 장치입니다.
- 이 시스템은 감지, 신호 처리, 데이터 스토리지 및 그래픽 디스플레이를위한 아날로그 및 디지털 하드웨어의 조합을 사용하여 소형 형식으로 임피던스 기반의 입자 검출의 쿨터 원칙을 고용합니다.
- 일회용 센서 셀 크기와 서브 마이크론과 하위 picoliter 해상도에서 셀 볼륨에 의해 차별을 가능하게 microfabricated, 셀 감지 영역에 설계되었습니다.
- 정밀 액체 처리 채널과 전자와 향상된, 샙터 전지 카운터 그래픽 히스토그램으로 세포 인구 통계를 표시합니다.
2. 카운팅을위한 단일 셀 서스펜션의 준비
- 샙터 셀 카운터를 사용하려면, 세포의 단일 세포 현탁액을 diluting로 시작, 인산의 생리 버퍼. ML 당 10,000-500,000 세포의 농도가 최적입니다.
- 1.5 ML의 microfuge 관에 희석 세포 100 μL을 전송합니다.
3. 샙터를 사용하여 셀 카운트 공연
- 악기의 뒷면에있는 토글 키를 누른 후 누른 샙터 셀 카운터 켜고 나타나는 화면의 지시에 나올 때까지 기다리는 것이 좋습니다.
- 메시지가 나타나면 악기의 앞쪽으로 향하게 전극 감지 패널로 샙터 단위의 끝에 센서를 부착합니다.
- 샙터 센서 전자 감지 영역 및 통합 셀 감지 전극과 정밀 성형 샘플링 챔버로 구성되어 있습니다. 센서는 가능한 서브 마이크론 해상도 셀 크기를 구별하고, 하위 picoliter 해상도 휴대폰 볼륨을합니다.
- 일관된 센서 공학, 동일한 샘플 볼륨이 계산되며 정확한 크기 측정이 만들어진 것을 보장합니다.
- 일단 센서는 다음과 같이 화면의 지시에 따라 계산 프로세스의 각 단계는 수행 첨부 :
- 화면이 읽을 때 "시작 플런저를 잡아,"플런저를 우울. 화면은 다음 "잠수함 센서를."읽습니다 세포 현탁액 솔루션으로 센서 및 센서에 세포 현탁액을 대기음하는 플런저를 풀어 잠수함.
- 플런저는 전기 신호로 작동하며 센서에 샘플 플러스 죽은 볼륨을 이끌어낼 수 있습니다. 그것이 pipetting과 마찬가지로 폭락의 속도 또는 정확도가 중요하지 않습니다. 이 과정은 몇 초 정도 걸립니다. 준비가되면 악기가 삐 것이며, "로드 샘플"이 화면에 표시됩니다.
- 일단 샘플이가 microchannels를 통해 다음, 세포 크기와 세포 볼륨을 평가하기 위해 감지 영역을 통해 그림이 그려진 센서에로드됩니다. 샘플 50 μL가 계산되면 센서가 카운팅 막을 수있는 계기를 알려줍니다.
- 계산이 완료되면, 악기의 화면은 "완료 세어보세요. 센서를 제거하고 삭제하십시오."읽습니다 프롬프트를 따라하고, 센서를 제거하고 폐기.
- 악기는 다음의 화면에서 셀 크기 또는 직경의 히스토그램뿐만 아니라 ML 당 세포 농도를 표시합니다.
4. 데이터 분석
- 계산이 완료되고 히스토그램이 악기에 표시되면, 토글 버튼을 눌러서 게이트를 적용합니다. "자동 게이팅"또는 자동으로 히스토그램 프로파일을 기반으로 게이트를 집합으로 "마지막 사용"또는 이전 계산의 성문을 사용을 선택합니다.
- 에 관계없이 선택의 문을 수동으로 미세 조정 데이터를 이동할 수 있습니다. 왼쪽 문을 선택하고 스크롤 다시 전환 버튼을 눌러원하는대로 게이트를 이동 ggle.
- 그런 다음 오른쪽 게이트를 활성화하고 올바른 게이트를 배치 전환을 스크롤 다시 전환을 누르십시오. 다시 클릭하여, 새로운 세포 농도, 평균 세포 부피와 직경이 표시됩니다.
- 토글도 날짜 사이의 디스플레이를 전환 양쪽으로 이동할 수, 시간, 셀 크기를 의미하고, 세포 볼륨을 의미합니다.
- 최대 72 histograms에는 악기 자체에 저장할 수 있습니다. 개인 컴퓨터에 데이터를 업로드하려면 디스플레이 화면의 USB 케이블 포트를 통해 악기를 연결합니다.
- PC에 두 번 "연결"을 누른 다음 소프트웨어를 실행하려면 샙터 소프트웨어 응용 프로그램을 클릭합니다. 모든 계산이 자동으로 소프트웨어에 포트를합니다.
- 샙터 어플 리케이션 소프트웨어는 볼륨이나 직경 중 하나의 문화의 인구 분포를 상세하게 히스토그램을 표시합니다. 다운로드한 파일은 원시 데이터가 지정된 셀 또는 셀 지름 볼륨의 용기에 표시됩니다 Microsoft Excel을로 내보낼 수 있습니다.
5. 대표 결과
- 나인틴 다른 세포 라인 카운트 위해 준비되었고 이론적 시작 농도는 쿨터 카운터를 사용하여 결정됩니다. 이러한 세포 suspensions 그러면 더욱 이론적 세포 농도에서 세포 suspensions를 얻을 희석되었다.
- 샙터 세포 카운터는 다음 세포 농도를 결정하는 데 사용되었다. 그림 1은 이론적으로 세포 농도와 함께 오 대표 세포 라인에 대한 측정되었다 5 dilutions를 보여줍니다.
- 로 R2의 값을로 표시 선형의 높은 정도, 그 샙터 카운트가 넓은 선형 작동 범위에 걸쳐, 테스트 세포 라인에 대한 안정적인 방법입니다 보여줍니다.
- 샙터 계수의 전반적인 상대 정확도는 샙터 계산에서 얻은 데이터가 쿨터 계산에서 얻은 계산과 비교하는 그림 2에서 증명됩니다.
- 샙터 셀 카운트의 로그 쿨터 카운트의 로그 역모를 꾸몄다하고, 테스트를 모든 세포 라인에 걸쳐, 샙터 카운트가 쿨터 카운트와 일치하는, 표시합니다.
- 19 셀 라인 카운트는 Z2 쿨터 카운터, 샙터 셀 카운터와 같은 바이올렛 - 셀 또는 셀 시스템과 같은 자동화된 비전 기반의 카운터, 그리고 hemocytemeter를 사용하여 수행되었습니다.
- 카운트는 정지와 동일한 dilutions를 시작하는 동일한 세포를 사용하여 제조 업체의 지시에 따라 수행되었다. 그림 3에 표시된 결과는 긴밀하게 높은 선형성과 함께 이론적으로 세포 농도와 일치 샙터는 계산에 의해 측정되는 세포 농도를 보여줍니다.
- 퍼센트 편차 계수, 또는 CV는 각각 집계 시스템에 대한 각 세포주의 각 희석 계산되었다. 그림 4는 세포 농도 및 계산 방법에 관한 19 셀 라인을 통해 평균 %의 CVS를 보여줍니다.
- 작동 범위 내에서 샙터 전지 카운터 작은 표준 편차와 변동 작은 평균 계수를 표시 비전을 기반으로 hemocytometer의 계산보다 더 정확합니다.
- 샙터 계산 열 배 hemocytometry보다 너무 다른 자동 카운터보다 빠릅니다. 그림 5, SF9, MCF7, 그리고 HEK293 세포의이 동영상에서 설명한 방법을 사용하여 계산되었다.
- 세포 농도를 측정하는 데 필요한 평균 시간이 기록되었다. hemocytometry은 샘플 당 한 번만 수행이라고합니다.
- 샙터는 셀 크기에 따라 측정합니다. 따라서 세포 형태의 변화는 히스토그램에서 캡처 수 있습니다. 건강하지 못한 세포는 lyse, 그리고 왼쪽에있는 히스토그램의 변화 (그림 6, 왼쪽 패널)을 일으킬 동안 건강한 문화는 좋은 종 모양의 가우스 분포를 표시합니다.
- 마찬가지로 50 %의 죽은 세포 인구가 50% 라이브 세포와 혼합되었을 때, 히스토그램 교대도 (그림 6, 오른쪽 패널) 관찰되었다.
Discussion
다른 계산 방법의 결과에 샙터 셀 카운터의 성능을 비교, 우리는이 새로운 휴대용, 자동 셀 카운터가 다양한 작동 범위에서 정확, 신속하고, 안정적인 셀 카운트를 제공 결론. 샙터 계수의 기능은 센서 팁 및 쿨터 원칙에 따라 정교한 계산 장비에 내장된 정밀 설계 기술의 결과입니다. 성능 품질은 속도를 증가시키고 세포 기반 assays의 재현성을 향상시키는 방법으로 계산 샙터을 제안합니다. 핸드헬드 형식은 세포 배양 후드에서 빠른 지겨움 무료로 집계 권리를 허용합니다.
Disclosures
캐슬린 Ongena, Chandreyee 다스, 재닛 L. 스미스, 소니아 길, 그리고 그레이스 존스톤이 문서에서 사용되는 악기를 생산 Millipore에 의해 고용됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter with 40 μm Scepter Sensors | EMD Millipore | PHCC20040 | |
| Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter with 60 μm Scepter Sensors | EMD Millipore | PHCC20060 | |
| Scepter Sensors, 60 μm | EMD Millipore | PHCC60050 | 50 Pack of sensors |
| Scepter Sensors, 40 μm | EMD Millipore | PHCC40050 | 50 Pack of sensors |
| Universal Power Adapter | EMD Millipore | PHCCPOWER | |
| Scepter O-Ring Kit | EMD Millipore | PHCCOCLIP | 2 O-rings and one filter cover |
References
- Barghshoon, S. Cell Counting Survey. , Millipore. (2009).
- Tucker, K. G., Chalder, S., al-Rubeai, M., Thomas, C. R. Measurement of hybridoma cell number, viability, and morphology using fully automated image analysis. Enzyme Microb Technol. 16 (1), 29-35 (1994).
- Houwen, B. Fifty years of hematology innovation: the Coulter principle. , Medical Laboratory Observer. (2003).
