Summary
Spira Cell Counter är en handhållen automatisk funktion som kan användas för att räkna celler, övervaka cell diameter och volym, och användas för att kontrollera hälsan och kvaliteten på cellpopulationer från en kultur till nästa.
Abstract
Räkna celler är ofta en nödvändig men tråkig steg för cellodling in vitro. Konsekvent cell koncentrationer se experimentella reproducerbarhet och noggrannhet. Blodkroppar viktiga för övervakning cell hälsa och spridning takt, bedömer immortalisering eller omvandling, sådd celler för senare experiment, transfektion eller infektion, och förberedelse för cell-baserade analyser. Det är viktigt att celler vara korrekt, konsekvent och snabbt, särskilt för kvantitativa mätningar av cellulära svar.
Trots detta behov av snabbhet och precision i cell räkna tillfrågade 71% av 400 forskare 1 som räknar celler med hjälp av en hemocytometer. Medan hemocytometry är billigt, det är mödosamt och under förutsättning att användaren partiskhet och missbruk, vilket resulterar i felaktiga räknas. Hemocytometers är tillverkade av speciella optiska glas som cellsuspensioner lastas i specificerade volymer och räknas i mikroskop. Felkällor i hemocytometry är: ojämn cell fördelning i urvalet, för många eller för få celler i provet, subjektiva beslut om huruvida en viss cell faller inom definierade räkna området, förorening av hemocytometer, användare-till-användare variation och variation av hemocytometer påfyllningshastigheten 2.
För att lindra den tristess i samband med manuell räkning, 29% av forskarna räkna celler med hjälp av automatiserade cell räknar enheter, dessa inkluderar Vision-baserade diskar, system som upptäcker celler med Coulter princip eller flödescytometri 1. För de flesta forskare, är det huvudsakliga hindret för att använda ett automatiserat system priset i samband med dessa stora bänk instrument 1.
Spira celltalsräknare är en automatiserad handhållen enhet som erbjuder automatisering och riktigheten av Coulter räkna på en relativt låg kostnad. Systemet sysselsätter Coulter principen om impedans-baserade partikel upptäckt 3 i en miniatyriserad format med en kombination av analog och digital hårdvara för avläsning, signalbehandling, datalagring och grafisk display. De disponibla tips är konstruerad med en mikrofabricerade, cell-sensing zon som möjliggör diskriminering av cellstorlek och cell volym på sub-micron och sub-picoliter upplösning. Förbättrad precision vätske-hantering kanaler och elektronik, rapporterar spira celltalsräknare statistik cellpopulation grafiskt visas som ett histogram.
Protocol
1. Vikten av Cell Räkna
- Räkna celler är en nödvändig men tråkig steg för cellodling in vitro.
- Konsekvent cell koncentrationer se experimentella reproducerbarhet och noggrannhet.
- Blodkroppar viktiga för övervakning cell hälsa och spridning takt, bedömer immortalisering eller omvandling, sådd celler för senare experiment, transfektion eller infektion, och förberedelse för cell-baserade analyser.
- Trots behovet av snabbhet och precision i cell räkna,, 71% av 400 forskare tillfrågade räkna celler med hjälp av en hemocytometer. Medan hemocytometry är billigt, det är mödosamt och under förutsättning att användaren partiskhet och missbruk, vilket resulterar i felaktiga räknas.
- Felkällor i hemocytometry är: ojämn cell fördelning i urvalet, för många eller för få celler i provet, subjektiva beslut om huruvida en viss cell faller inom definierade räkna området, förorening av hemocytometer, användare-till-användare variation och variation av hemocytometer fyllnadsgrad.
- För att lindra den tristess i samband med manuell räkning, 29% av forskarna räkna celler med hjälp av automatiserade cell räknar enheter. Men för de flesta forskare, är priset i samband med dessa stora bänkbaserade instrument som ett hinder för deras användning.
- Spira celltalsräknare är en automatiserad handhållen enhet som erbjuder automatisering och riktigheten av Coulter räkna på en relativt låg kostnad.
- Systemet sysselsätter Coulter principen om impedans-baserade partikel upptäckt i en miniatyriserad format med en kombination av analog och digital hårdvara för avläsning, signalbehandling, datalagring och grafisk display.
- De disponibla sensorn är konstruerad med en mikrofabricerade, cell-sensing zon som möjliggör diskriminering av cellstorlek och cell volym på sub-micron och sub-picoliter upplösning.
- Förbättrad precision vätske-hantering kanaler och elektronik, visar spira celltalsräknare grafiskt statistik cellpopulation som ett histogram.
2. Beredning av en enda cell, suspension Counting
- För att kunna använda disken Scepter cellen, börja med att späda en enda cell suspension av celler, fosfatbuffrad saltlösning. En koncentration av 10,000-500,000 celler per ml är optimal.
- Överföring 100 mikroliter av utspädd celler till ett 1,5 ml mikrofugrör.
3. Utföra blodkroppar med spiran
- Slå på spiran celltalsräknare genom att trycka och hålla växla på baksidan av instrumentet och vänta på att instruktionerna på skärmen ska visas.
- När du uppmanas att fästa en sensor i slutet av spira enheten med elektroden avkänning panelen vänd mot framsidan av instrumentet.
- Spira Sensorerna består av en gjuten precision provtagning kammare, med en elektronisk avkänning zon och integrerad cell-avkänning elektroder. Sensorerna gör det möjligt att diskriminera cellstorlek på submikrona upplösning och cellvolym på sub-picoliter upplösning.
- Konsekvent sensor teknik, ser till att lika provvolymer räknas och exakta storlek mätningar görs.
- När givaren är ansluten, utför varje steg i räkna processen enligt instruktionerna på skärmen enligt följande:
- När skärmen lyder "Håll ned kolven för att börja", tryck in kolven. Skärmen kommer då att läsa "dränka givaren." Sänk ner sensorn i cellsuspension lösningen och släpp kolven för att aspirera cellsuspension in i sensorn.
- Kolven fungerar som en elektrisk signal och kommer att dra urvalet plus dödvolym in i sensorn. Hastigheten eller riktighet kasta sig spelar ingen roll som det gör med pipettering. Denna process kommer att ta flera sekunder. När du är klar kommer instrumentet pipa och "Sample laddade" visas på skärmen.
- När provet är laddad i sensorn är det dras genom avkänningszonen att bedöma cellstorlek och cellvolym, sedan genom mikrokanaler. När 50 mikroliter av provet räknas sensorn berättar instrument för att sluta räkna.
- När räkningen är klar kommer instrumentets skärm läsa "Räkna Komplett. Ta bort sensorn och kasta." Följ uppmaningen och ta bort och kasta sensorn.
- Instrumentet kommer då att visa ett histogram över cellens storlek eller diameter på sin skärm samt cellkoncentrationen per ml.
4. Data Analysis
- När räkningen är klar och histogram visas på instrumentet, applicera portar genom att trycka på strömknappen. Välj "Auto gating" eller "användning sista" att antingen automatiskt ställa in porten utifrån histogrammet profil, eller att använda portar från tidigare räknare.
- Oavsett val, kan portarna manuellt flyttas för att finjustera uppgifterna. Tryck på strömknappen igen för att välja den vänstra porten och rulla tillggle att flytta grinden som önskat.
- Tryck sedan växla igen för att aktivera den högra grinden och rulla växla för att placera rätt gate. Klicka igen, en ny cell koncentration, genomsnittlig cell volym och diameter visas.
- Den växlar också kan flyttas till endera sidan för att växla mellan datum, tid, menar cellstorlek och menar cell volym.
- Upp till 72 histogram kan lagras på själva instrumentet. För att ladda upp data till en dator, bifoga instrumentet via USB-kabeln porten på skärmen.
- På PC, dubbelklicka på spiran programvara för att starta programmet och klicka sedan på "Anslut". Allt räknas automatiskt port till programmet.
- Spira Application Software visar histogram med uppgifter om befolkningens fördelning av kulturen i antingen volym eller diameter. Nedladdade filer kan sedan exporteras till Microsoft Excel, där rådata visas i soptunnor för angiven cell diameter eller volymer cell.
5. Representativa resultat
- Nitton olika cellinjer var förberedda på att räkna och teoretiska utgångspunkter koncentrationer bestämmas med hjälp av en Coulter Counter. Dessa cellsuspensioner därefter spädas vidare för att få cellsuspensioner på teoretisk cell koncentrationer.
- Spira celltalsräknare användes sedan för att bestämma cell koncentrationer. Figur 1 visar 5 spädningar som mätts i 5 representativa cellinjer tillsammans med den teoretiska cellkoncentrationen.
- Den höga graden av linjäritet som anges av R2-värden, visar att spira räkna är en tillförlitlig metod för cellinjer testades, över ett brett linjär räckvidd.
- Den totala relativa noggrannhet Scepter räkna visas i figur 2, där data från spira räknar jämförs med räkningar från Coulter räknar.
- Loggen av Scepter blodkroppar plottas mot stocken av Coulter räknas, och visar att, i alla testade cellinjer, spira räknar match Coulter räknas.
- Räknar med 19 cellinjer utfördes med hjälp av en Z2 Coulter Counter, spira celltalsräknare, en automatiserad syn-baserad disk som Vi-cell eller Otaliga system och en hemocytemeter.
- Räknar utfördes enligt tillverkarens anvisningar, med samma cell börjar fjädring och identiska spädningar. Resultaten visas i Figur 3 visar att cellen koncentrationer som uppmätts av Scepter räkna matchar teoretiska cell koncentrationer med hög linjäritet.
- Andelen variationskoefficient, eller CV, beräknades för varje spädning av varje cellinje för varje räknesystem. Figur 4 visar den genomsnittliga% CV drygt 19 cellinjer med avseende på cellkoncentrationen och räknar metod.
- Inom arbetsområdet är spira celltalsräknare mer exakt än vision baserad hemocytometer räkna, visning av små standardavvikelser och mindre genomsnittlig variationskoefficienterna.
- Spira räkna är tio gånger snabbare än hemocytometry och snabbare än andra automatiserade räknare också. I Figur 5, SF9, MCF7 och HEK293 celler räknades med hjälp av de metoder som beskrivs i denna video.
- Den genomsnittliga tid som krävs för att mäta cellkoncentrationen spelades in. Observera att hemocytometry utfördes endast en gång per prov.
- Spira gör mätningar baserade på cellstorlek. Således förändringar i cellulära morfologi kan fångas i histogrammet. Friska kulturer visa en fin klockformad normalfördelning, medan sjuka celler, Lyse, och orsaka en förskjutning i histogrammet åt vänster (Figur 6, till vänster).
- Likaså när en befolkning på 50% döda celler var blandade med 50% levande celler, var histogrammet flyttas också observeras (figur 6, högra panelen).
Discussion
Jämföra prestanda spira celltalsräknare till resultaten från andra räknar metoder kan vi dra slutsatsen att den nya handhållna, automatiserad celltalsräknare ger precis, snabb och pålitlig celltal över ett brett arbetsområde. Funktionaliteten i Scepter räkna är ett resultat av den precision konstruerade tekniken inbäddade i sensorn spets och sofistikerade räknar instrumentering baserad på Coulter principen. Föreställningen kvalitet föreslår Scepter räknas som metod för att öka hastigheten och förbättra reproducerbarheten för cell-baserade analyser. Den handhållna formatet ger snabb tristess fritt räkna höger vid cellodling huven.
Disclosures
Kathleen Ongena, Chandreyee Das, Janet L. Smith, Sonia Gil, och Grace Johnston är anställda av Millipore, som producerar de instrument som används i denna artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter with 40 μm Scepter Sensors | EMD Millipore | PHCC20040 | |
| Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter with 60 μm Scepter Sensors | EMD Millipore | PHCC20060 | |
| Scepter Sensors, 60 μm | EMD Millipore | PHCC60050 | 50 Pack of sensors |
| Scepter Sensors, 40 μm | EMD Millipore | PHCC40050 | 50 Pack of sensors |
| Universal Power Adapter | EMD Millipore | PHCCPOWER | |
| Scepter O-Ring Kit | EMD Millipore | PHCCOCLIP | 2 O-rings and one filter cover |
References
- Barghshoon, S. Cell Counting Survey. , Millipore. (2009).
- Tucker, K. G., Chalder, S., al-Rubeai, M., Thomas, C. R. Measurement of hybridoma cell number, viability, and morphology using fully automated image analysis. Enzyme Microb Technol. 16 (1), 29-35 (1994).
- Houwen, B. Fifty years of hematology innovation: the Coulter principle. , Medical Laboratory Observer. (2003).
