Determinação do Número celular durante Cultura Celular usando o contador de células Scepter

Summary

O contador de células Scepter é um dispositivo portátil automático que pode ser usado para contagem de células, monitor de diâmetro celular e volume, e ser usado para verificar a saúde e qualidade de populações celulares de uma cultura para outra.

Abstract

Contagem de células é muitas vezes um passo necessário, mas tedioso para in vitro de cultura de células. Concentrações de células consistente garantir a reprodutibilidade e precisão experimental. Contagem de células são importantes para a vigilância da saúde e taxa de proliferação celular, avaliando imortalização ou transformação, para posterior semeadura células experimentos de transfecção, ou infecção, e preparação para celular baseado em ensaios. É importante que as contagens de células ser precisa, consistente e rápido, especialmente para medições quantitativas de respostas celulares.

Apesar desta necessidade de rapidez e precisão na contagem de células, 71% de 400 pesquisadores entrevistaram ^uma contagem de células que usando um hemocitômetro. Enquanto hemocytometry é barato, é trabalhoso e sujeito a viés de usuário e uso indevido, o que resulta na contagem imprecisa. Hemocytometers são feitas de vidro óptico especial em que suspensões de células são carregados em volumes especificados e contadas sob um microscópio. Fontes de erros na hemocytometry incluem: distribuição desigual de células na amostra, muitas ou poucas células na amostra, decisões subjetivas quanto a saber se uma determinada célula cai dentro da área de contagem definido, a contaminação do hemocitômetro, de usuário para usuário variação e variação da taxa de enchimento hemocitômetro ^2.

Para aliviar o tédio associado com a contagem manual, 29% dos pesquisadores contagem de células usando células automatizado de contagem dispositivos, que incluem a visão baseada em contadores, sistemas que detectam as células usando o princípio Coulter, ou citometria de fluxo ^1. Para a maioria dos pesquisadores, a principal barreira ao uso de um sistema automatizado é o preço associado a essas grandes instrumentos de bancada ^1.

O contador de células Scepter é um dispositivo automático de mão que oferece a automação e precisão de contagem Coulter, a um custo relativamente baixo. O sistema emprega o princípio Coulter de impedância baseado em detecção de partículas ³ em um formato miniaturizado usando uma combinação de hardware analógico e digital para a detecção, processamento de sinais, armazenamento de dados e visualização gráfica. A ponteira descartável é projetada com um microfabricated, zona de células-sensing que possibilita a discriminação por tamanho de célula e do volume celular em sub-micron e sub-picoliter resolução. Reforçada com precisão líquido de manipulação de canais e eletrônica, o contador de células Scepter relatórios de estatísticas de células população graficamente como um histograma.

Protocol

1. A Importância da contagem de células

1. As células de contagem é um passo necessário, mas tedioso para in vitro de cultura de células.
2. Concentrações de células consistente garantir a reprodutibilidade e precisão experimental.
3. Contagem de células são importantes para a vigilância da saúde e taxa de proliferação celular, avaliando imortalização ou transformação, para posterior semeadura células experimentos de transfecção, ou infecção, e preparação para celular baseado em ensaios.
4. Apesar da necessidade de velocidade e precisão na contagem de células, 71% de 400 pesquisadores entrevistaram contagem de células utilizando um hemocitômetro. Enquanto hemocytometry é barato, é trabalhoso e sujeito a viés de usuário e uso indevido, o que resulta na contagem imprecisa.
5. Fontes de erro em hemocytometry incluem: distribuição desigual de células na amostra, muitas ou poucas células na amostra, decisões subjetivas quanto a saber se uma determinada célula cai dentro da área de contagem definido, a contaminação do hemocitômetro, de usuário para usuário variação , variação e da taxa de hemocitômetro de enchimento.
6. Para aliviar o tédio associado com a contagem manual, 29% dos pesquisadores contagem de células usando dispositivos de células automatizado de contagem. No entanto, para a maioria dos pesquisadores, o preço associado a essas grandes instrumentos de bancada é uma barreira à sua utilização.
7. O contador de células Scepter é um dispositivo automático de mão que oferece a automação e precisão de contagem Coulter, a um custo relativamente baixo.
8. O sistema emprega o princípio Coulter de impedância baseado em detecção de partículas em um formato miniaturizado usando uma combinação de hardware analógico e digital para a detecção, processamento de sinais, dados, armazenamento e visualização gráfica.
9. O sensor disponível é projetado para receber uma microfabricated, zona de células-sensing que possibilita a discriminação por tamanho de célula e do volume celular em sub-micron e sub-picoliter resolução.
10. Reforçada com precisão líquido de manipulação de canais e eletrônica, o contador de células Scepter graficamente exibe estatísticas de população de células como um histograma.

2. Preparação de uma suspensão de células isoladas de Contagem

1. Para usar o contador de células Scepter, comece diluindo uma suspensão única célula de células, em tampão fosfato salino. A concentração de células por mL 10,000-500,000 é o ideal.
2. Transferir 100 mL de células diluída para um microtubo de 1,5 mL.

3. Realizar a contagem de células usando o Scepter

1. Ligar o contador de células Scepter pressionando e segurando a alternância na parte de trás do instrumento e aguarde as instruções na tela para aparecer.
2. Quando solicitado, conecte um sensor para o fim da unidade Scepter com o painel de eletrodo sensor de virada para a frente do instrumento.
3. Sensores cetro consistem em uma câmara de amostragem precisamente modulada, com uma zona de sensoriamento eletrônico e integrado de células-sensing eletrodos. Os sensores permitem discriminar tamanho da célula em sub-micron, resolução e volume de células em sub-picoliter resolução.
4. Sensor de engenharia consistente, garante que os volumes de amostra igual são contados e as medições são feitas tamanho exato.
5. Uma vez que o sensor é conectado, executar cada passo do processo de contagem de acordo com as instruções na tela da seguinte forma:
6. Quando a tela lê "Mantenha o êmbolo para começar", o êmbolo. A tela, então, ler "submergir o sensor." Submergir o sensor na solução de suspensão de células e solte o êmbolo para aspirar a suspensão celular para o sensor.
7. O êmbolo age como um sinal elétrico e vai chamar a amostra mais o volume morto no sensor. A velocidade ou precisão de mergulhar não importa como faz com pipetagem. Este processo vai demorar vários segundos. Quando estiver pronto, o instrumento emite um sinal sonoro, e "Amostra carregado" será exibido na tela.
8. Uma vez que a amostra é carregado no sensor, ela é puxada através da zona de detecção para avaliar o tamanho das células e volume da célula e, em seguida pelos microcanais. Uma vez que 50 mL de amostra é contado o sensor diz ao instrumento para parar a contagem.
9. Após a contagem estiver concluída, a tela do instrumento irá ler "contagem completa. Por favor, remova o sensor e descarte." Siga o prompt, e remover e descartar o sensor.
10. O instrumento irá exibir um histograma de tamanho de célula ou de diâmetro em sua tela, bem como a concentração de células por ml.

4. Análise de Dados

1. Após a contagem é completo eo histograma é mostrada no aparelho, aplicar portas pressionando o botão de alternância. Selecione "gating auto" ou "último uso" quer definir automaticamente o portão com base no perfil do histograma, ou para usar as portas a partir da contagem anterior.
2. Independentemente da seleção, os portões podem ser movidos manualmente para ajustar os dados. Pressione o botão alternar novamente para selecionar a porta a esquerda e para rolar aggle para mover o portão, como desejado.
3. Em seguida, pressione a alternar novamente para ativar a porta à direita e percorrer a alternar para colocar o portão certo. Clique novamente, uma nova célula de concentração, o volume celular médio e diâmetro será exibida.
4. A alternância também pode ser movido para qualquer lado para alternar a exibição entre data, hora, a média do tamanho das células, ea média do volume da célula.
5. Até 72 histogramas podem ser armazenados no próprio instrumento. Para carregar os dados para um computador pessoal, anexe o instrumento através da porta USB do cabo na tela.
6. No PC, clique duas vezes sobre a Aplicação de Software Scepter para o lançamento do software, em seguida, clique em "connect". Todas as acusações serão automaticamente porta para o software.
7. O Software Aplicativo Scepter mostra o histograma detalhando a distribuição da população da cultura em volume ou diâmetro. Arquivos baixados poderão ser exportados para o Microsoft Excel, onde os dados brutos serão exibidos em caixas de diâmetros célula especificada ou volumes de células.

5. Resultados representante

1. Dezenove diferentes linhagens celulares foram preparados para contagem e concentrações de partida teóricos foram determinados utilizando um contador Coulter. Estas suspensões de células foram então diluída para obter suspensões de células em concentrações célula teórica.
2. O contador de células Scepter foi então usada para determinar as concentrações de células. A Figura 1 mostra cinco diluições que foram medidos para cinco linhagens de células representante junto com a concentração de células teórica.
3. O alto grau de linearidade, conforme indicado pelos valores R2, demonstra que a contagem Scepter é um método confiável para as linhagens celulares testadas, através de uma ampla faixa operacional linear.
4. A precisão global relativa de contagem Scepter é demonstrado na Figura 2, em que os dados obtidos da contagem Scepter são comparados com as contagens obtidas Contando Coulter.
5. O log da contagem de células Scepter é plotado contra o log da contagem de Coulter, e mostra que, em todas as linhagens, conta Scepter coincidir com contagem de Coulter.
6. Contagem de 19 linhas de células foram realizadas usando um Z2 Coulter Counter, o contador de células Scepter, um contador automático baseado em visão, como Vi-Cell ou sistema de incontáveis, e um hemocytemeter.
7. As contagens foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante, usando a mesma célula de partida de suspensão e diluição idênticos. Os resultados mostrados na Figura 3 demonstram que as concentrações de células medido pela contagem Scepter coincidem com concentrações de células teórica com alta linearidade.
8. O percentual de variação, ou CV, foi calculado para cada diluição de cada linha de células para cada sistema de contagem. A Figura 4 mostra os currículos% em média mais de 19 linhagens de células com respeito à concentração de células e método de contagem.
9. Dentro da faixa de operação, o contador de células Scepter é mais preciso do que a visão baseada contagem hemocitômetro, exibindo menores desvios-padrão e menores coeficientes médios de variação.
10. Contagem cetro é dez vezes mais rápido que hemocytometry e mais rápido que outros contadores automáticos também. Na Figura 5, Sf9, MCF7 e HEK293 células foram contadas utilizando os métodos descritos neste vídeo.
11. O tempo médio necessário para medir a concentração de células foi registrada. Note-se que hemocytometry foi realizada apenas uma vez por amostra.
12. Cetro faz medições com base no tamanho da célula. Assim, quaisquer alterações na morfologia celular podem ser capturados no histograma. Culturas saudáveis ​​exibir um belo sino distribuição de Gauss em forma, enquanto as células saudáveis, lyse, e causar uma mudança no histograma para a esquerda (Figura 6, painel esquerdo).
13. Da mesma forma, quando uma população de 50% de células mortas foram misturados com 50% de células vivas, as mudanças histograma também foram observados (Figura 6, painel direito).

Discussion

Comparando o desempenho do contador de células Scepter com resultados de outros métodos de contagem, podemos concluir que este novo handheld, contador de células automatizado oferece contagens de células precisa, rápida e confiável através de uma ampla faixa operacional. A funcionalidade de contagem Scepter é um resultado da tecnologia de engenharia de precisão embutido na ponta do sensor ea instrumentação sofisticada contagem baseada no princípio de Coulter. A qualidade de desempenho sugere Scepter contando como método para aumentar a velocidade e melhorar a reprodutibilidade de ensaios baseados em células. O formato handheld permite tédio rápida direita livre contagem na capa de cultura de células.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter with 40 μm Scepter Sensors	EMD Millipore	PHCC20040
Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter with 60 μm Scepter Sensors	EMD Millipore	PHCC20060
Scepter Sensors, 60 μm	EMD Millipore	PHCC60050	50 Pack of sensors
Scepter Sensors, 40 μm	EMD Millipore	PHCC40050	50 Pack of sensors
Universal Power Adapter	EMD Millipore	PHCCPOWER
Scepter O-Ring Kit	EMD Millipore	PHCCOCLIP	2 O-rings and one filter cover