Uma vez que um gene é identificada como potencialmente refratário para o vírus da dengue, deve ser avaliado para o seu papel na prevenção de infecções virais dentro do mosquito. Este protocolo ilustra como a extensão das infecções por dengue de mosquitos podem ser ensaiadas. As técnicas para crescer o vírus em cultura, alimentando-se membrana de sangue os mosquitos humanos e assaying títulos viral no intestino médio do mosquito são demonstradas.
O objetivo deste procedimento é para infectar o mosquito Aedes com o vírus da dengue em uma condição de laboratório e examinar o nível de infecção e dinâmica do vírus nos tecidos do mosquito. Este protocolo é utilizado rotineiramente para o estudo de interações mosquito-vírus, especialmente para a identificação de novos fatores de host que são capazes de determinar a competência vetorial. Todo o experimento deve ser realizado em um laboratório BSL2. Semelhantes às infecções Plasmodium falciparum, traje apropriado, incluindo luvas e jaleco deve ser usado em todos os momentos. Após o experimento, todos os materiais que entraram em contato com o vírus precisam ser tratados com etanol 75% e branqueadas antes de prosseguir com a lavagem normal. Todos os outros materiais devem ser autoclavados antes de descartá-los.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Incubator | with 5% CO2, 37oC | |||
50 mL conical tubes | plastic | |||
human serum and blood | O+ | |||
pipette tip | for tissue culture | |||
pipettman | ||||
Pasteur pipetts | glass, sterile | |||
water bath | 37C | |||
centrifuge | ||||
parafilm | ||||
circulating water bath | ||||
glass membrane feeders | with rubber tubing to fit feeders | |||
mosquito cups | ||||
75% ethanol | ||||
10% bleach | ||||
Tissue-culture plates | 6-well, 24-well and 96-well plates | |||
Petri dish | glass | |||
Slides | ||||
fine-tip forceps | ||||
PBS | 1X, sterile | |||
dissecting microscope | Microscope | |||
C6/36 cells | cells | For virus propagation | ||
C6/36 medium | MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin. | |||
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride | Sigma | D5905 | 1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 µl of 30% hydrogen peroxidase | |
30% hydrogen peroxidase | ||||
A. aegypti | Animal | mosquito |