Summary
हम एक प्रक्रिया है जिसके द्वारा दो आयामी विश्लेषण agarose जेल प्रतिकृति मध्यवर्ती कि यूवी विकिरण के बाद होते हैं की संरचना को पहचानने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्तमान.
Abstract
डीएनए की क्षति की उपस्थिति में गलत प्रतिकृति सेलुलर rearrangements और mutagenesis के सभी प्रकार की कोशिकाओं में मनाया और व्यापक रूप से मनुष्यों में कैंसर के विकास के साथ सीधे जुड़े होने का विश्वास के बहुमत के लिए जिम्मेदार है. यूवी विकिरण से प्रेरित के रूप में डीएनए की क्षति, गंभीर जीनोमिक टेम्पलेट सही नकली प्रतिकृति की क्षमता impairs. जीन उत्पादों की एक संख्या की पहचान की गई है कि जब प्रतिकृति टेम्पलेट में डीएनए घावों मुठभेड़ों आवश्यक हैं. हालांकि, एक शेष चुनौती प्रतिकृति के दौरान इन प्रोटीनों कैसे प्रक्रिया घावों का निर्धारण किया गया है
Protocol
1. ग्रोथ और यूवी किरणन.
- 200μl एक ताजा रातोंरात प्लाज्मिड pBR322 डेविस 1 मध्यम में बड़े 0.4% ग्लूकोज, 0.2% casamino एसिड, और 10 / μg मिलीलीटर थिमाइन (DGCthy मध्यम) और 100 μg / मिलीलीटर एम्पीसिलीन के साथ पूरक युक्त संस्कृति के pelleted है . सेल गोली तो 200μl DGCthy एम्पीसिलीन कमी मध्यम में resuspended है और DGCthy माध्यम के 20 मिलीलीटर टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया.
- संस्कृतियों को मिलाते इनक्यूबेटर में 37 एम्पीसिलीन चयन ° सी के बिना 0.5 के एक आयुध डिपो 600 (~ 5 x 10 8 / कोशिकाओं मिलीलीटर) के लिए बड़े हो रहे हैं. एम्पीसिलीन बिना विकास असामान्य या अनुत्पादक प्रतिकृति मध्यवर्ती है कि कुछ म्यूटेंट में उत्पन्न हो सकती है के खिलाफ चयन से बचा जाता है. इसके अलावा, अगर पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करने के लिए क्षति प्रेरित, मीडिया से एम्पीसिलीन को हटाने के लिए आवश्यक है क्योंकि यह इन तरंगदैर्य और ढाल कोशिकाओं पर दृढ़ता से अवशोषित, यूवी के प्रभावी खुराक को कम करने.
- पीली रोशनी के तहत कार्य, संस्कृति, एक 15cm व्यास पेट्री डिश में आंदोलन के लिए एक rotating मंच पर रखा गया है. हमारे संस्कृतियों एक 15 वाट germicidal दीपक कि ~ 1 J/m2/sec, जो एक UVC photometer का उपयोग करने के लिए मापा जाता है एक जोखिम दर का उत्पादन से एक दूरी पर रखा जाता है. संस्कृतियों J/m2 50 के साथ विकिरणित हैं और फिर वापस में तुरंत रखा प्रयोग की अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर मिलाते हुए. इस खुराक औसत, 1 cyclobutane pyrimidine ssDNA के हर 4.5 केबी डिमर पर उत्पादन. पीले प्रकाश photolyase द्वारा cyclobutane pyrimidine dimers के photoreactivation उलटा रोकता है.
2. अलगाव डीएनए.
- बार जब प्रतिकृति मध्यवर्ती करने के लिए जांच की जा रहे हैं पर, 0.75 संस्कृति के मिलीलीटर विभाज्य 0.75 मिलीलीटर बर्फ ठंड NET30 बफर (100 मिमी NaCl, 10 मिमी Tris, 8.0 पीएच, 30 मिमी EDTA) में रखा गया है और के अंत तक बर्फ पर रखा समय बेशक. आम तौर पर हम 0 पर जांच के नमूने, 15, 30, 45, 60, और 90 मिनट के साथ एक 90 मिनट का समय बेशक, चलाने. EDTA और ठंडे तापमान प्रतिकृति और nucleotide काटना की मरम्मत के लिए प्रभावी ढंग से रोक सेवा.
- प्रत्येक नमूना तो है pelleted, 1.5 मिलीग्राम / एमएल lysozyme और 0.2 मिलीग्राम / एमएल ते में RNaseA (10 मिमी Tris, 8.0 पीएच, 1 मिमी EDTA) के 150 μl में resuspended है, और 37 डिग्री सेल्सियस lysed 20 मिनट के लिए. इस समय, proteinase (10mg/ml) कश्मीर और sarkosyl 20% के 10μl के 10μl और जोड़ रहे हैं ऊष्मायन 1 घंटे के लिए जारी रखने की अनुमति दी है. Proteinase कश्मीर और sarkosyl कि झिल्ली या प्रोटीन के साथ जुड़ा हो सकता है पहले phenol के निष्कर्षण होता है डीएनए टुकड़े जारी की मदद करते हैं. के बाद से सक्रिय नकल डीएनए अक्सर प्रोटीन या झिल्ली परिसरों के लिए बाध्य है, इस प्रतिकृति टुकड़े कि बरामद कर रहे हैं की उपज में वृद्धि में मदद करता है.
- नमूने तो प्रत्येक नमूने के phenol के 2 मात्रा जोड़ने और ट्यूबों 5 मिनट के लिए धीरे औंधा कर रहे हैं द्वारा निकाले जाते हैं. तो 2 / क्लोरोफॉर्म isoamyl शराब (24 / 1) की मात्रा और जोड़ रहे हैं ट्यूबों धीरे 5 मिनट के लिए कर रहे हैं फिर उलटा.
- नमूने 5 मिनट और प्रत्येक नमूना के शीर्ष जलीय चरण के लिए एक microcentrifuge में 14,000 rpm पर centrifuged कर रहे हैं हटा दिया है और एक ताजा ट्यूब में रखा. तब 4 / क्लोरोफॉर्म isoamyl शराब (24 / 1) की मात्रा जोड़ रहे हैं, ट्यूब 5 मिनट के लिए धीरे औंधा कर रहे हैं, और फिर 5 मिनट के लिए 14,000 rpm पर centrifuged.
- शीर्ष, प्रत्येक नमूने में जलीय चरण तो एक 47mm वाटमान 0.025 सुक्ष्ममापी ताकना डिस्क है जो एक बीकर में 0.1X ते की 250 मिलीलीटर पर तैरता पर प्रत्येक नमूने के 100μl खोलना है 1 घंटे के लिए dialyzed. क्योंकि भी कतरा क्षेत्रों या शाखा अंक के साथ नकल संरचनाओं और कर्तन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, हम आमतौर पर हमारे विंदुक युक्तियाँ काट एक धार के साथ मुंह व्यापक बनाने के लिए और बाल काटना बलों के कम से कम. Pipetting सामान्य में, एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए के बाद जब तक डीएनए प्रतिबंध एंजाइमों के साथ किया गया पचता है.
- (न्यू इंग्लैंड Biolabs) PvuII जो प्लाज्मिड प्रतिकृति के मूल से बस बहाव linearizes के साथ प्रत्येक नमूना तो पचता है.
- Agarose जेल, 100μl क्लोरोफॉर्म और 6X लोड हो रहा है रंजक है कि Bromophenol ब्लू और Xylene Cyanol शामिल के 20μl में लोड करने से पहले प्रत्येक नमूना के लिए जोड़ रहे हैं और मिश्रित. फिर, जलीय लोडिंग डाई युक्त चरण के 40μl जेल में भरी हुई है. संरचनात्मक biases, संरचनात्मक कलाकृतियों, और डीएनए कर्तन को कम करने के लिए, इस अलगाव प्रक्रिया के किसी भी कदम भी कतरा क्षेत्रों, वेग, सेल lysis के बाद या डीएनए के नमूने ध्यान केंद्रित के लिए समृद्ध को शामिल नहीं करता है.
3. 2D जेल और दक्षिणी विश्लेषण.
- 2 - आयामी विश्लेषण agarose जेल 3 से संशोधित किया गया है. 1ST आयाम के लिए, प्रतिबंधित डीएनए नमूने एक 0.4% agarose जेल के माध्यम से 1V/cm में 1X TBE में चलाए जा रहे हैं. 10X TBE स्टॉक समाधान की एक लीटर में शामिल हैं:
- 108 छ Tris बेस
- 55 छ बोरिक एसिड
- 40 मिलीलीटर 0.5m EDTA (8.0 पीएच)
- एक लैम्ब्डा हिंद III आकार मार्कर पहली गली में भरी हुई है, तो नमूने हर दूसरे गली में लोड कर रहे हैं. आम तौर पर हम पहले घ चलानेimension 12-15 बजे ~. गलियों लंघन है यह आसान गलियों का टुकड़ा करने के लिए बाहर दूसरे आयाम में डाली बनाता है. कम वोल्टेज और कम प्रतिशत agarose जेल डीएनए मुख्यतः आकार पर आधारित टुकड़े अलग कार्य करता है.
- दूसरा आयाम के लिए, जेल गलियों पहली आयाम जेल के एक बड़े कसाई चाकू का उपयोग कर कटा हुआ हैं. पहली लैम्ब्डा हिंद क्ष्क्ष्क्ष् मार्कर युक्त लेन ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग जा सकता है. एक गाइड, फसल के रूप में लैम्ब्डा हिंद III के मार्कर का उपयोग और है कि जेल के नीचे है जहां linearized प्लाज्मिड चलाने की उम्मीद है के क्षेत्र त्यागें. इन शर्तों के तहत, हम पाते हैं कि linearized pBR322 xylene cyanol दाग से थोड़ा ऊपर चलता है.
- दूसरा आयाम डाली करने के लिए, क्षैतिज प्रत्येक लेन एक खाली जेल ढलाईकार के शीर्ष भर में रखा गया है. 1X TBE में 1.0% agarose की एक समाधान के लिए तैयार है और 55 डिग्री सेल्सियस करने के लिए ठंडा इस समय, जेल समाधान में डाल दिया है दूसरा आयाम डाली, पूरी तरह से जेल स्लाइस को कवर सुनिश्चित करने के. एक बार जेल की स्थापना की है, यह 6.5V/cm पर एक वैद्युतकणसंचलन इकाई है कि बफर recirculate करने की अनुमति देता में चलाया जाता है. हम आम तौर पर दूसरा आयाम ~ 5.5-7 बजे चलाते हैं. उच्च वोल्टेज और उच्च प्रतिशत agarose जेल को प्रभावी ढंग से डीएनए टुकड़े उनके आकार के आधार पर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आकार अलग है. Nonlinear आकृतियों दूसरा आयाम के माध्यम से और अधिक धीरे - धीरे चलाते हैं.
- निम्नलिखित वैद्युतकणसंचलन जेल तो एच 2 हे में rinsed है, 400ml 0.25M हाइड्रोक्लोरिक एसिड में दो बार 15 मिनट, एच 2 हे के साथ rinsed के लिए धोया, और फिर 30 मिनट के लिए 400 मिलीलीटर 0.4M NaOH में दो बार धोया. एसिड के छोटे टुकड़े कि और अधिक कुशलता से स्थानांतरण में आंशिक रूप से निक डीएनए अणु की सेवा washes. इस कदम की वजह से बड़े आकार और डीएनए प्रतिकृति मध्यवर्ती के असामान्य आकार के लिए आवश्यक है.
- जैल में डीएनए तो एक Hybond एन को सौंप दिया है + नायलॉन 4 झिल्ली. हम 0.4M NaOH के साथ एक नीचे क्षार हस्तांतरण प्रणाली का उपयोग करें. संक्षेप में, सोख्ता कागज 0.4M NaOH में भिगो के दो चादरें कागज तौलिए के एक बड़े ढेर पर रखा जाता है. नायलॉन झिल्ली भी 0.4M NaOH में भिगो है और स्याहीचट के शीर्ष पर रखा है. जेल तो ध्यान से इस के शीर्ष पर स्तरित, सोख्ता कागज का एक टुकड़ा, NaOH समाधान में गीला द्वारा पीछा किया. अंत में, गीला सोख्ता कागज का एक लंबा टुकड़ा शीर्ष भर में स्तरित है और इसके दोनों सिरों 0.4M NaOH समाधान बाती के रूप में सेवा की एक एल युक्त बर्तन में रखा जाता है. हम आम तौर पर 6-12 घंटे के लिए डीएनए स्थानांतरण.
- नायलॉन झिल्ली निकाल दिया जाता है, 5X एसएससी बफर में 20-30 सेकंड धोए, और एक संकरण रोलर 10.5ml Prehybridization समाधान युक्त बोतल में रखा. फिर, झिल्ली 42 डिग्री सेल्सियस रोटेशन के साथ 6hrs से अधिक के लिए incubated है. Prehybridization समाधान:
- 5.0 मिलीलीटर formamide
- 0.5 मिलीलीटर 20% एसडीएस
- 2.5 मिलीलीटर 20X एसएससी *
- 2.0 मिलीलीटर 50X Denhardt *
- 0.5 मिलीलीटर सामन शुक्राणु डीएनए (10mg/ml)
एसएससी और Denhardt * व्यंजनों के लिए 5 में पाया जा सकता है
- Prehybridization अवधि के दौरान, 1 pBR322 प्लाज्मिड के μg 32P साथ निक अनुवाद रॉश का उपयोग अल्फा [32 पी] - dCTP लेबल द्वारा आपूर्ति प्रोटोकॉल के अनुसार लेबल है. radiolabeled जांच (100μl) 98 पर incubating द्वारा विकृत है ° सी एक पेंच टोपी microcentrifuge ट्यूब में 10 मिनट के लिए, और फिर तुरंत बर्फ पर रखा है.
- विकृत जांच 5.9 मिलीलीटर संकरण समाधान है, जिसमें शामिल है:
- 3.0 मिलीलीटर formamide
- 1.5 मिलीलीटर एसएससी
- 1.0 मिलीलीटर एच 2 हे
- 0.15 मिलीलीटर 50X है Denhardt
- 0.10 मिलीलीटर 20% एसडीएस
- 0.15 मिलीलीटर 10mg/ml सामन शुक्राणु डीएनए
- prehybridization समाधान रोलर बोतल के बाहर डाल दिया है और संकरण समाधान के अंदर डाल दिया है रोलर बोतल तो 12hrs की तुलना में अधिक के लिए 42 ° सी इनक्यूबेटर और घुमाया लौट.
- संकरण समाधान रोलर बोतल के बाहर डाल दिया है. फिर, दाग ~ एक धोने के रोटेशन के साथ 0.5X एसएससी, 42 में 0.1% एसडीएस ° सी युक्त समाधान के 150 मिलीलीटर के साथ रोलर की बोतल में 20 मिनट के लिए 4 बार धोया जाता है.
- पिछले धोने के बाद, झिल्ली एक कागज तौलिया पर रखा गया है जब तक तरल दिख गायब हो गया है. झिल्ली तो polyvinyl क्लोराइड प्लास्टिक की चादर में लिपटे है और एक phosphorimager स्क्रीन करने के लिए अवगत कराया. हम कल्पना और एक 840 तूफान और इसके संबद्ध ImageQuant सॉफ्टवेयर का उपयोग रेडियोधर्मिता यों.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1. प्लाज्मिड प्रतिकृति मध्यवर्ती और यूवी प्रेरित डीएनए की क्षति की उपस्थिति या अनुपस्थिति में मनाया PvuII के प्रवास पैटर्न pBR322 प्लाज्मिड 2D-agarose जेल विश्लेषण द्वारा मनाया पचता है. Diagrammed. गैर नकल रैखिक plasmids एक रेखीय टुकड़ा 4.4-केबी के रूप में चलाते हैं. नकल plasmids वाई के आकार का संरचनाओं कि गैर नकल उनके बड़े आकार की वजह से टुकड़े की तुलना में धीमी और कोई विस्थापित फार्मnlinear आकार. इस प्रवास पैटर्न एक आर्क है कि रैखिक क्षेत्र से अच्छी तरह से बाहर की ओर फैली रूपों. यूवी के विकिरण, डबल वाई या एक्स आकार के अणुओं है कि वाई के आकार के अणुओं की चाप की तुलना में और अधिक धीरे - धीरे उत्प्रवासित शंकु क्षेत्र में मनाया जाता है. 2D जेल के दक्षिणी विश्लेषण का एक उदाहरण 32P लेबल pBR322 के साथ जांच यूवी विकिरण और यूवी विकिरण (प्रकाशक से अनुमति के साथ reproduced) के बाद 15 मिनट के बाद तुरंत कोशिकाओं के लिए दिखाया गया है.
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Discussion
विशिष्ट उपस्थिति और यूवी प्रेरित क्षति के अभाव में जंगली प्रकार की कोशिकाओं से प्राप्त परिणामों चित्र 1 में दिखाया जाता है. क्षति के अभाव में, कुल प्लास्मिड डीएनए का ~ 1% Y चाप में पाया जा सकता है जब कोशिकाओं घातीय चरण में तेजी से बढ़ रहे हैं. विकिरण के बाद, वाई के आकार का अणु में एक क्षणिक वृद्धि के रूप में अवरुद्ध प्रतिकृति कांटे क्षतिग्रस्त स्थलों पर जमा मनाया जाता है. एक्स आकार प्रतिकृति मध्यवर्ती भी transiently जमा और एक समय है कि जब घावों की मरम्मत कर रहे हैं के साथ संबद्ध जब तक जारी रहती है.
दक्षिणी विश्लेषण के स्थान में, प्रतिकृति मध्यवर्ती जेल के बाहर छिद्रित कर सकते हैं एक प्लास्टिक पीने के भूसे के साथ, शुद्ध, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सीधे मनाया. हम इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक करने के लिए जीन प्रतिकृति कांटे कि डीएनए की क्षति को मुठभेड़ और असामान्य प्रतिकृति मध्यवर्ती है कि इन म्यूटेंट में जमा की पहचान की प्रक्रिया के लिए आवश्यक उत्पादों की पहचान. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण को आसानी से डीएनए की क्षति के अन्य रूपों की जांच करने के लिए संशोधित कर सकते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हमारी प्रयोगशाला में कार्य राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन और NIGMS NIH से क्षेत्र R15GM86839 अनुदान से रोजगार MCB0551798 पुरस्कार द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer |
| 0.025 μm pore disks | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | Floating dialysis disks |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease |
| Nick-translation kit | Roche Group | 976776 | To make 32P-labeled probe |
| Blotting Paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | For Southern transfer |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli. Science. 299, 1064-1067 (2003).
- Friedman, K. L., Brewer, B. J. Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).
- Spivak, G., Hanawalt, P. C. Determination of damage and repair in specific DNA sequences. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A laboratory manual. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli. J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli. Genetics. 166, 1631-1640 (2004).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli. J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).
- Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest. J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli. Radiat Res. 168, 499-506 (2007).
- Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions. Mutat Res. 645, 19-26 (2008).
