ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג'ל ניתוח

Summary

אנו מציגים הליך שבאמצעותו דו מימדי agarose ג'ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את מבנה ביניים שכפול המתרחשות בעקבות קרינה UV.

Abstract

שכפול מדויק בנוכחות נזק לדנ"א אחראי על רוב rearrangements הסלולר mutagenesis נצפתה בכל סוגי התאים הוא האמין נרחב כדי להיות מקושר ישירות עם התפתחות של סרטן בבני אדם. נזק לדנ"א, כגון זה הנגרם על ידי קרינת UV, קשות ביכולתם של שכפול לשכפל את הגנום תבנית מדויקת. מספר מוצרים הגן זוהו נדרשים כאשר שכפול ה-DNA מפגשים נגעים בתבנית. עם זאת, האתגר שנותר היה לקבוע כיצד החלבונים האלה נגעים במהלך תהליך השכפול

Protocol

1. צמיחה הקרנת UV.

1. 200μl של תרבות לילה טרי פלסמיד המכיל את pBR322 גדל דייויס בינוני ¹ בתוספת גלוקוז 0.4%, 0.2% חומצות casamino, ו -10 מיקרוגרם / מ"ל תימין (בינוני DGCthy) ו -100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין הוא pelleted. התא הוא גלולה resuspended אז בינוני DGCthy 200μl חסר אמפיצילין ומשומשים לחסן 20 מ"ל של מדיום DGCthy.
2. תרבויות גדלים ללא בחירה אמפיצילין ב חממה רועד ב 37 ° C עד ₆₀₀ OD של 0.5 (~ 5 x 10 ⁸ תאים / מ"ל). צמיחה ללא אמפיצילין נמנע מבחר ביניים נגד שכפול חריגה או יצרניים שעלולות להתעורר בתוך כמה מוטציות. בנוסף, אם באמצעות אור UV כדי לגרום נזק, הסרת אמפיצילין מהתקשורת הוא הכרחי משום שהוא סופג בתוקף על אורכי גל אלה מגינים על התאים, להפחית את המינון האפקטיבי של UV.
3. עבודה תחת אורות צהובים, התרבות ממוקם צלחת בקוטר 15 ס"מ פטרי על פלטפורמה מסתובבת על תסיסה. התרבויות שלנו ממוקמות במרחק מנורה 15 וואט קוטל חידקים שמייצר שיעור החשיפה של ~ 1 J/m2/sec, הנמדד באמצעות פוטומטר UVC. תרבויות הם מוקרן עם 50 J/m2 ואז להציב מיד בחזרה לתוך רעד 37 ° C החממה למשך הניסוי. מינון זה מייצר, בממוצע, 1 cyclobutane פירימידין dimer כל 4.5 קילו של ssDNA. תאורה צהובה מונע photoreactivation-היפוך של הדימרים פירימידין cyclobutane ידי photolyase.

2. בידוד ה-DNA.

1. לפעמים כאשר ביניים שכפול הם להיבדק, aliquot 0.75 מ"ל של התרבות מכניסים 0.75 הצפת מ"ל קרח קר NET30 (100 mM NaCl, 10 mM טריס, pH 8.0, 30 mM EDTA) והניח על הקרח עד סוף את הקורס הזמן. אנחנו בדרך כלל להפעיל כמובן זמן 90 דקות, עם דגימות שנבדקו על 0, 15, 30, 45, 60, ו - 90 דקות. EDTA וטמפרטורה קרה לשרת ביעילות להפסיק שכפול ותיקון כריתה נוקלאוטיד.
2. מדגם כל כך pelleted, resuspended ב μl 150 ליזוזים של 1.5 מ"ג / מ"ל ​​ו - 0.2 מ"ג / מ"ל ​​RNaseA ב TE (10 mM טריס, pH 8.0, 1 mM EDTA), ו lysed על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. בשלב זה, 10μl של proteinase K (10mg/ml) ו 10μl sarkosyl של 20% נוספים ואת הדגירה הוא הורשה להמשיך עבור שעות 1. Proteinase K ו sarkosyl לעזור לשחרר את שברי דנ"א עשויה להיות קשורה הממברנה או חלבונים לפני מיצוי פנול מתרחשת. מאז שכפול ה-DNA באופן פעיל כרוכה לעתים קרובות קומפלקסים חלבונים או קרום, זה עוזר להגדיל את התשואה של שברי שכפול, כי הם החלימו.
3. דוגמאות המחולצים אז על ידי הוספת 2 כרכים של פנול לטעום כל הצינורות הם הפוכים בעדינות במשך 5 דקות. ואז 2 כרכים של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (24 / 1) מתווספות ואת צינורות הם הפוכים בעדינות שוב במשך 5 דקות.
4. דוגמאות centrifuged ב 14,000 סל"ד ב microcentrifuge במשך 5 דקות ואת השלב מימית העליון של המדגם כל מוסר, והניח לתוך צינור טריים. אז 4 כרכים של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (24 / 1) מתווספות, הצינורות הם הפוכים בעדינות במשך 5 דקות, centrifuged שוב 14,000 סל"ד במשך 5 דקות.
5. השלב העליון, מימית במדגם כל dialyzed מכן על ידי תצפית 100μl המדגם על כל דיסק 47mm 0.025 מיקרומטר Whatman הנקבוביות אשר צף על 250 מ"ל של 0.1X TE בכוס במשך שעה 1. בגלל מבנים שכפול עם אזורים גדיל בודד או נקודות סניף רגישים יותר גז, אנחנו בדרך כלל לגזור את קצות פיפטה שלנו עם סכין גילוח לעשות פה יותר ולמזער את כוחות הגזירה. באופן כללי, pipetting צריך להישמר עד למינימום עד אחרי ה-DNA כבר מעוכל עם אנזימי הגבלה.
6. מדגם כל מעוכל לאחר מכן עם PvuII (ניו אינגלנד Biolabs) אשר linearizes הפלסמיד רק במורד הזרם מן המקור של שכפול.
7. לפני העמסה של ג'ל agarose, 100μl כלורופורם 20μl של צבע טעינת 6X המכיל Cyanol כחול קסילן Bromophenol מתווספים מדגם כל מעורבות. ואז, 40μl השלב מימית המכילה את צבען טוען הוא נטען לתוך הג'ל. כדי למזער הטיות מבניות, חפצים מבניות, הגז DNA, הליך זה הבידוד אינו כולל את השלבים הבאים כדי להעשיר עבור אזורים גדיל בודד, נמהרת, או לרכז את דגימות DNA לאחר תמוגה התא.

3. 2D ג'ל וניתוח הדרום.

1. 2 מימדי agarose ג'ל ניתוח הוא שונה מ 3. עבור ממד -1, דגימות ה-DNA מוגבל מופעלים באמצעות 0.4% agarose ג'ל 1X TBE ב 1V/cm. ליטר אחד של פתרון TBE 10X מניות מכילה:
   • 108 גרם טריס Base
   • 55 גרם חומצת בור
   • 40 מ"ל 0.5m EDTA (pH 8.0)
2. סמן הינד למבדה III גודל נטען במסלול הראשון, ואז דגימות נטענים בכל שביל אחר. אנחנו בדרך כלל בטווח ד firstimension ~ 12-15 שעות. דילוג על נתיבי מקלה על הפרוסה נתיבים החוצה להטיל בממד השני. מתח נמוך נמוך אחוז agarose ג'ל משמש כדי להפריד בין קטעי דנ"א מבוססת בעיקר על גודל.
3. עבור הממד השני, נתיבי ג'ל הם פרוסים מתוך ג'ל הממד הראשון באמצעות סכין קצבים גדול. במסלול הראשון המכיל את סמן למבדה הינד III יכול להיות מוכתם ברומיד ethidium. באמצעות סמן למבדה הינד III כמו יבול מדריך, וזורקים את האזור של ג'ל כי הוא מתחת היכן הפלסמיד לינארית צפוי לרוץ. בתנאים אלה, אנו מוצאים כי pBR322 לינארית רץ מעט מעל cyanol קסילן הכתם.
4. כדי להפיל את הממד השני, נתיב אחד ממוקם בצורה אופקית לרוחב החלק העליון של גלגלית ג'ל ריקה. הפתרון של agarose 1.0% ב 1X TBE מוכן ומקורר עד 55 ° C. בשלב זה, הפתרון הוא ג'ל זרמו להטיל את המימד השני, מוודא כדי לכסות לחלוטין את פרוסות ג'ל. לאחר ג'ל הציבה, היא לרוץ 6.5V/cm ביחידה אלקטרופורזה המאפשר למאגר כדי recirculate. אנחנו בדרך כלל להפעיל את המימד השני ~ 5.5-7 שעות. מתח גבוה גבוה אחוז agarose ג'ל ביעילות המפריד בין שברי DNA המבוססת על הצורה שלהם, כמו גם גודל. צורות קוי לרוץ יותר לאט דרך הממד השני.
5. לאחר אלקטרופורזה, הג'ל היא שטפה אז H ₂ O, שטף פעמיים 400ml של חומצה הידרוכלורית 0.25M במשך 15 דקות, לשטוף עם H ₂ O;, ורחץ אז פעמיים 400 מ"ל 0.4M NaOH במשך 30 דקות. חומצה שוטף לשרת באופן חלקי ניק מולקולות DNA לרסיסים קטנים יותר להעביר בצורה יעילה יותר. צעד זה הוא הכרחי בשל גודל גדול של צורות יוצא דופן ביניים שכפול הדנ"א.
6. הדנ"א של הג'לים הוא הועבר לאחר מכן N Hybond + קרום ניילון ^4. אנו משתמשים במערכת מטה העברת אלקלי עם NaOH 0.4M. בקצרה, שני גיליונות נייר סופג ספוג 0.4M NaOH ממוקמות על ערימה גדולה של מגבות נייר. הממברנה ניילון ספוגה גם 0.4M NaOH והניח על גבי נייר סופג. הג'ל הוא אז שכבתית בזהירות על גבי זה, ואחריו עוד חתיכה של נייר סופג, הרטובות בפתרון NaOH. לבסוף, חתיכה ארוכה של נייר סופג הרטובות היא שכבתית לרוחב החלק העליון ואת שני הקצוות שלה ממוקמים לתוך מנות המכיל 1 ליטר של תמיסת NaOH 0.4M לשמש הפתיל. אנחנו בדרך כלל לאפשר את העברת ה-DNA של 6-12 שעות.
7. קרום ניילון מוסר, שטף 20-30 שניות בתוך מאגר SSC 5X, והניח בתוך בקבוק הכלאה רולר המכיל פתרון Prehybridization 10.5ml. ואז, הממברנה היא מודגרות ב 42 ° C עם רוטציה יותר 6hrs. Prehybridization פתרון:
   • 5.0 מ"ל לפוראמיד
   • 0.5 מ"ל 20% SDS
   • 2.5 מ"ל 20X SSC *
   • 2.0 מ"ל של 50X Denhardt *
   • זרע 0.5 מ"ל סלמון DNA (10mg/ml)
     * מתכונים SSC ו Denhardt זה ניתן למצוא 5
8. במהלך התקופה prehybridization, 1 מיקרוגרם של pBR322 פלסמיד התווית 32P בתרגום הכינוי לפי הפרוטוקול מסופק על ידי אלפא רוש באמצעות שכותרתו [32-P], dCTP. החללית radiolabeled (100μl) הוא מפוגל ידי דוגרים על 98 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בתוך צינור כובע בורג microcentrifuge, ולאחר מכן הניח מיד על הקרח.
9. החללית מפוגל מתווסף פתרון 5.9 מ"ל הכלאה, אשר מכיל:
   • 3.0 מ"ל לפוראמיד
   • 1.5 מ"ל SSC
   • 1.0 מ"ל H ₂ O
   • 0.15 מ"ל של 50X Denhardt
   • 0.10 מ"ל 20% SDS
   • 0.15 מ"ל זרע 10mg/ml סלמון DNA
10. הפתרון prehybridization נמזג מהבקבוק הרים את הפתרון הכלאה הוא שפך פנימה בקבוק רולר הוא חזר אז על 42 מעלות צלזיוס חממה וסובב יותר 12hrs.
11. הפתרון הכלאה נמזג מהבקבוק הרים. ואז, כתם הוא שטף 4 פעמים למשך 20 דקות בבקבוק 150 מ"ל עם רולר ~ של פתרון לשטוף המכיל SSC 0.5X, SDS 0.1% ב 42 ° C עם רוטציה.
12. בעקבות לשטוף האחרון, קרום מושם על מגבת נייר עד הנוזל נעלם לעין. הממברנה הוא עטוף מכן לעטוף פוליוויניל כלוריד, פלסטיק חשוף למסך phosphorimager. אנו לחזות ולכמת את הרדיואקטיביות באמצעות סטורם 840 ותוכנה ImageQuant הקשורים אליו.

4. נציג תוצאות:

באיור 1. ביניים שכפול פלסמיד נצפתה נוכחות והיעדר נזק UV-Induced DNA. הדפוס ההגירה של PvuII מתעכל pBR322 פלסמיד ציין ידי ניתוח 2D-agarose ג'ל הוא ניתח. Non-שכפול פלסמידים ליניארי לרוץ כמו שבר 4.4 קילו ליניארי. פלסמידים שכפול טופס בצורת האות V מבנים להעביר איטי יותר מאשר אי - שכפול שברי בשל גודל גדול שלהם לאnlinear צורה. דפוס ההגירה צורות קשת המשתרע מן האזור ליניארי לעבר הבאר. בעקבות UV-קרינה, פעמיים Y או X בצורת מולקולות הם נצפו באזור חרוט כי נודד לאט יותר מאשר קשת של Y בצורת מולקולות. דוגמה של ניתוח הדרומי של הג'ל 2D נחקר עם 32P שכותרתו pBR322 מוצג עבור תאים מיד לאחר הקרנת UV ו 15 דקות לאחר הקרנת UV (לשכפל באישור המו"ל).

Discussion

תוצאות אופייניות שהתקבלו תאים סוג בר בנוכחות והיעדר נזק UV-Induced מוצגים באיור 1. בהעדר נזק, ~ 1% מה-DNA של פלסמיד הכולל ניתן למצוא קשת Y כאשר התאים גדל במהירות בשלב מעריכי. בעקבות הקרנה, גידול חולפות מולקולות בצורת Y הוא ציין כמו מזלגות שכפול חסום לצבור באתרים שניזוקו. ה-X בצורת ביניים שכפול גם transiently מצטברים להתמיד עד אשר תואמת כאשר הנגעים הם תוקנו.

במקום ניתוח הדרום ביניים שכפול ניתן אגרוף מתוך הג'ל עם קשית שתייה מפלסטיק, מטוהרים, וצפו ישירות על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים. השתמשנו בגישה זו בהצלחה לזיהוי מוצרים גן נדרש תהליך מזלגות שכפול שהמפגש נזק דנ"א כדי לזהות ביניים שכפול חריג מצטברים מוטנטים אלו. בנוסף, גישה זו ניתן לשנות בקלות לבחון את צורות אחרות של נזק לדנ"א.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
An example of the Southern analysis of the 2D gel probed	GE Healthcare	G15T8	Yellow Lighting
15 μwatt germicidal lamp	Sylvania	F20T12/GO	UV Lamp
Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm	Daigger	EF28195T	UVC photometer
0.025 μm pore disks	Whatman, GE Healthcare	VSWP04700	Floating dialysis disks
PvuII	Fermentas	ER0632	Restriction Endonuclease
Nick-translation kit	Roche Group	976776	To make 32P-labeled probe
Blotting Paper	Whatman, GE Healthcare	3030-704	For Southern transfer
Nylon membrane	GE Healthcare	RPN203S	For Southern transfer