Summary
Se presenta un procedimiento por el cual puede ser de dos dimensiones de agarosa-gel de análisis para identificar la estructura de los intermediarios de replicación que se producen después de la irradiación UV.
Abstract
Replicación inexacta en la presencia de daño en el ADN es el responsable de la mayoría de los reordenamientos celulares y mutagénesis observado en todos los tipos celulares y se cree que estar directamente asociado con el desarrollo del cáncer en los seres humanos. Daños en el ADN, como la inducida por la radiación UV, que limita enormemente la capacidad de replicación de duplicar la plantilla de genómica precisa. Una serie de productos de los genes han sido identificados que son necesarios cuando se encuentra con la replicación de las lesiones del ADN en la plantilla. Sin embargo, un desafío pendiente ha sido la de determinar cómo estas lesiones proceso de las proteínas durante la replicación
Protocol
1. El crecimiento y la radiación ultravioleta.
- 200μl de un cultivo fresco durante la noche que contiene el plásmido pBR322 crecido en medio de una Davis suplementado con 0,4% de glucosa, 0,2% casaminoácidos, y 10 mg / ml timina (medio DGCthy) y 100 ug / ml ampicilina es granulado. El pellet de células se resuspende entonces en un medio de DGCthy 200μl falta de ampicilina y se utiliza para inocular 20 ml de medio DGCthy.
- Los cultivos son cultivados sin selección a la ampicilina en una incubadora de agitación a 37 ° C a una OD 600 de 0,5 (~ 5 x 10 8 células / ml). Crecimiento sin ampicilina evita la selección contra intermediarios de replicación anormal o improductivos que pueden surgir en algunos mutantes. Además, si se utiliza la luz ultravioleta para inducir daño, la eliminación de la ampicilina de los medios de comunicación es necesaria, ya que absorbe fuertemente en estas longitudes de onda y los escudos de las células, la reducción de la dosis efectiva de radiación UV.
- Que trabajan bajo las luces amarillas, la cultura se encuentra en un diámetro de 15cm placa de Petri en una plataforma giratoria para la agitación. Nuestras culturas se colocan a una distancia de una lámpara de 15 vatios germicida que produce una tasa de exposición de aproximadamente 1 J/m2/sec, que se mide con un fotómetro de UVC. Las culturas son irradiados con 50 J/m2 y luego se coloca inmediatamente detrás en el temblor 37 ° C incubadora para la duración del experimento. Esta dosis produce, en promedio, un ciclobutano pirimidina dímero cada 4,5 kb de ADN de cadena simple. La iluminación amarilla impide fotorreactivación-inversión de los dímeros de pirimidina ciclobutano por fotoliasa.
2. De aislamiento de ADN.
- En momentos en que los intermediarios de replicación se han de examinar, una alícuota de 0,75 ml de la cultura se coloca en 0,75 ml de hielo frío NET30 buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 30 mM EDTA) y se coloca en hielo hasta el final de el transcurso del tiempo. Por lo general un curso de 90 minutos, con muestras examinadas a los 0, 15, 30, 45, 60 y 90 minutos. El EDTA y la temperatura fría sirven para detener efectivamente la replicación y la reparación por escisión de nucleótidos.
- Cada muestra se sedimentaron, se resuspendieron en 150 ml de 1,5 mg / ml de lisozima y 0,2 mg / ml RNAseA en TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA), y lisadas a 37 ° C durante 20 min. En este tiempo, 10μl de proteinasa K (10mg/ml) y 10μl de 20% sarkosyl se añadió la incubación se permite que continúe durante 1 hora. Proteinasa K y sarkosyl ayudan a liberar fragmentos de ADN que pueden estar asociados con la membrana o las proteínas antes de la extracción con fenol se produce. Dado que el ADN en replicación activa es a menudo obligados a complejos de proteínas o de la membrana, esto ayuda a aumentar el rendimiento de la replicación de los fragmentos que han sido recuperadas.
- Las muestras se extraen mediante la adición de 2 volúmenes de fenol para cada muestra y los tubos se vuelve a invertir durante 5 minutos. A continuación, dos volúmenes de cloroformo / alcohol isoamílico (24 / 1) se agregan y los tubos se vuelve a invertir de nuevo durante 5 minutos.
- Las muestras se centrifugan a 14.000 rpm en una microcentrífuga durante 5 minutos y la fase superior acuosa de cada muestra se retira y se coloca en un tubo nuevo. A continuación, cuatro volúmenes de cloroformo / alcohol isoamílico (24 / 1) se añaden, los tubos se vuelve a invertir durante 5 minutos y se centrifuga de nuevo a 14.000 rpm durante 5 minutos.
- La fase superior acuosa, en cada muestra se dializa durante 1 hora en manchas 100μl de cada muestra en un disco de 47 mm Whatman 0.025 micras de poro que flota en 250 ml de 0,1 X TE en un vaso. Porque las estructuras de replica con las regiones solo filamento o puntos de ramificación son más susceptibles al corte, por lo general reducir nuestras puntas de pipeta con una hoja de afeitar para hacer la boca más ancha y reducir al mínimo las fuerzas de cizallamiento. En general, las pipetas deben mantenerse al mínimo hasta que el ADN ha sido digerido con enzimas de restricción.
- Cada muestra se digiere con PvuII (New England Biolabs), que alinea el plásmido justo abajo de el origen de replicación.
- Antes de la carga en el gel de agarosa, el cloroformo y 100μl 20μl de colorante de carga 6X que contiene cyanol azul de bromofenol y xileno se añadió a cada muestra y se mezcla. Entonces, 40μl de la fase acuosa que contiene el colorante de carga se carga en el gel. Para minimizar los sesgos estructurales, artefactos estructurales, y cortar el ADN, el procedimiento de aislamiento no incluye ninguna medida para enriquecer a las regiones sola hebra, precipitado, o concentrar las muestras de ADN después de la lisis celular.
3. Gel 2D y Análisis del Sur.
- El 2-dimensional de agarosa-gel análisis se ha modificado a partir del 3. Para la 1 ª dimensión, las muestras de ADN restringido se ejecutan a través de un gel de agarosa 0,4% en TBE 1X en 1V/cm. Un litro de solución 10X TBE contiene acciones:
- 108 g de Tris Base
- 55 g de ácido bórico
- 40 ml de EDTA 0,5 M (pH 8,0)
- A lambda posteriores marcador de tamaño III se carga en el primer carril, las muestras se cargan en cada carril. Por lo general ejecuta la primera dIMENSIÓN ~ 15.12 hrs. Saltarse los carriles es más fácil de cortar las rutas a lanzar en la segunda dimensión. El bajo voltaje y baja por ciento en gel de agarosa sirve para separar los fragmentos de ADN sobre todo en función del tamaño.
- Para la segunda dimensión, carriles de gel se cortan fuera de la primera dimensión de gel con un cuchillo de carnicero de grandes. El primer carril que contiene el marcador lambda HindIII se puede teñir con bromuro de etidio. Con el marcador lambda HindIII como guía, cortar y desechar la región del gel que se encuentra por debajo en el plásmido linealizado se espera que funcione. En estas condiciones, nos encontramos con que pBR322 linearizado encuentra ligeramente por encima de la mancha cyanol xileno.
- Para lanzar la segunda dimensión, cada carril se coloca horizontalmente en la parte superior de un lanzador de gel vacías. Una solución de 1,0% de agarosa en TBE 1X se prepara y se enfría a 55 ° C. En este momento, la solución de gel se vierte en el molde para la segunda dimensión, asegurándose de cubrir completamente las rodajas de gel. Una vez que el gel se ha puesto, que se ejecuta en 6.5V/cm en una unidad de electroforesis, que permite la recirculación de la memoria intermedia. Nosotros normalmente se ejecuta la segunda dimensión ~ 5.5-7 horas. El alto voltaje y alta por ciento en gel de agarosa separa eficazmente los fragmentos de ADN en base a su forma, así como el tamaño. Formas no lineales se ejecutan más lentamente a través de la segunda dimensión.
- Tras la electroforesis, el gel se enjuaga en H 2 O, se lavaron dos veces en 400 ml de ácido clorhídrico 0,25 M durante 15 minutos, se lavan con H 2 O;, y luego se lavan dos veces en 400 ml de NaOH 0,4 M durante 30 minutos. El ácido se lava sirven para nick parcialmente las moléculas de ADN en fragmentos más pequeños que la transferencia más eficiente. Este paso es necesario debido al gran tamaño y formas poco comunes de los intermediarios de replicación del ADN.
- El ADN de los geles se transfiere entonces a un Hybond N + membrana de nylon 4. Usamos un sistema de baja transferencia de álcali con 0,4 M NaOH. En resumen, dos hojas de papel secante empapado en 0,4 M de NaOH se colocan en una gran pila de toallas de papel. La membrana de nylon también empapado en 0,4 M de NaOH y se coloca en la parte superior del papel secante. El gel es cuidadosamente por capas en la parte superior de este, seguido de otro pedazo de papel secante, mojada en la solución de NaOH. Por último, una larga pieza de papel secante mojado es en capas en la parte superior y sus dos extremos se colocan en una vajilla que contiene 1 L de solución de NaOH 0,4 M para servir como una mecha. Por lo general permiten la transferencia de ADN de 6-12 hrs.
- La membrana de nylon, se lava 20-30 segundos en Buffer 5X SSC, y se coloca en una botella de rodillos de hibridación que contenía solución de prehibridación 10.5ml. A continuación, la membrana se incuba a 42 ° C con rotación por más de 6 horas. Prehibridación solución:
- 5,0 ml de formamida
- 0,5 ml de 20% SDS
- 2,5 ml de 20X SSC *
- * 2.0 ml 50X Denhardt
- 0,5 ml de esperma de salmón de ADN (10mg/ml)
* Recetas para la CSS y de Denhardt se puede encontrar en cinco
- Durante el período de prehibridación, 1 g de plásmido pBR322 es marcado con 32P por nick de traducción de acuerdo con el protocolo suministrado por Roche con la etiqueta alfa [32 P]-dCTP. La sonda marcada radiactivamente (100μl) se desnaturaliza mediante la incubación a 98 ° C durante 10 minutos en un tubo de microcentrífuga de tornillo de la tapa y se coloca inmediatamente en hielo.
- La sonda desnaturalizada se añade 5,9 ml de solución de hibridación, que contiene:
- 3,0 ml de formamida
- 1,5 ml de SSC
- 1,0 ml de H 2 O
- 0,15 ml 50X Denhardt
- 0,10 ml de 20% SDS
- 0,15 ml de esperma de salmón 10mg/ml ADN
- La solución de prehibridación se derrama de la botella de rodillo y la solución de hibridación se vierte pulg La botella de rodillos se devuelve a los 42 ° C incubadora y se gira desde hace más de 12 horas.
- La solución de hibridación se derrama de la botella de rodillo. Entonces, la mancha se lavaron 4 veces durante 20 minutos en la botella de rodillos con ~ 150 ml de una solución de lavado que contiene 0,5 X SSC, 0,1% SDS a 42 ° C con rotación.
- Tras el último lavado, la membrana se coloca sobre una toalla de papel hasta que el líquido ha desaparecido visiblemente. La membrana se envuelve en papel de plástico de polivinilo de cloruro y se expone a una pantalla phosphorimager. Nos visualizar y cuantificar la radiactividad con una tormenta de 840 y su software asociado ImageQuant.
4. Los resultados representativos:
Figura 1. Intermediarios de replicación del plásmido observada en la presencia y ausencia de daño en el ADN inducido por UV. El patrón de migración de PvuII digerido plásmido pBR322 observado por 2D-gel de agarosa-análisis es un diagrama. No repetición de los plásmidos lineales se ejecute como un lineal de 4,4 kb fragmento. Plásmidos replicar la forma en forma de Y las estructuras que migran más lentamente que los fragmentos no replican debido a su mayor tamaño y noforma nlinear. Este patrón de migración en forma de arco que se extiende desde la región lineal hacia el pozo. Después de la irradiación UV, doble-Y o moléculas en forma de X se observan en la región del cono que se desplaza más lentamente que el arco en forma de Y de las moléculas. Un ejemplo del análisis de Southern del gel 2D probaron con marcado con 32P pBR322 se muestra de las células inmediatamente después de la irradiación UV y 15 minutos después de la irradiación UV (reproducido con permiso del editor).
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Discussion
Los resultados típicos obtenidos a partir de células de tipo salvaje en presencia y ausencia de daño inducido por UV se muestra en la Figura 1. En la ausencia de daños, aproximadamente el 1% del ADN total de plásmido se puede encontrar en el arco Y cuando las células están creciendo rápidamente en la fase exponencial. Después de la irradiación, un aumento transitorio de las moléculas en forma de Y se observa como las horquillas de replicación bloqueadas se acumulan en los sitios dañados. Los intermediarios de replicación en forma de X también transitoriamente se acumulan y persisten hasta el momento que se correlaciona con las lesiones cuando se reparan.
En lugar de los análisis de Southern, los intermediarios de replicación se pueden perforar fuera del gel con una pajita de plástico, se purifica, y la observación directa al microscopio electrónico. Hemos utilizado este método con éxito para identificar productos de los genes necesarios para procesar las horquillas de replicación de ese encuentro el daño del ADN e identificar a los intermediarios de replicación anormal que se acumula en estos mutantes. Además, este enfoque puede ser fácilmente modificado para examinar otras formas de daño en el ADN.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El trabajo en nuestro laboratorio con el apoyo de Career Award MCB0551798 de la Fundación Nacional de Ciencia y AREA conceder R15GM86839 de la NIGMS-NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer |
| 0.025 μm pore disks | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | Floating dialysis disks |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease |
| Nick-translation kit | Roche Group | 976776 | To make 32P-labeled probe |
| Blotting Paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | For Southern transfer |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
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