Summary
We presenteren een procedure waarbij twee-dimensionale agarose-gel analyse kan worden gebruikt om de structuur van de replicatie tussenproducten die optreden na UV-straling te identificeren.
Abstract
Onnauwkeurige replicatie in de aanwezigheid van DNA-schade is verantwoordelijk voor het merendeel van de cellulaire herschikkingen en mutagenese waargenomen in alle celtypes en wordt algemeen aangenomen dat direct geassocieerd met de ontwikkeling van kanker bij de mens. DNA-schade, zoals die veroorzaakt door UV-straling, vermindert sterk het vermogen van replicatie naar de genomische template nauwkeurig te dupliceren. Een aantal van gen-producten zijn geïdentificeerd die nodig zijn voor het replicatie ontmoetingen DNA laesies in de sjabloon. Er is echter een resterende uitdaging is hoe deze eiwitten te bepalen laesies tijdens replicatie
Protocol
1. Groei en UV-straling.
- 200μl van een verse 's nachts de cultuur die het plasmide pBR322 gekweekt in Davis medium 1 aangevuld met 0,4% glucose, 0,2% casamino zuren, en 10 ug / ml thymine (DGCthy medium) en 100 ug / ml ampicilline is gekorreld. De cel pellet wordt vervolgens geresuspendeerd in 200μl DGCthy medium zonder ampicilline en wordt gebruikt om 20 ml DGCthy medium enten.
- Culturen zijn geteeld zonder ampicilline selectie in een incubator schudden bij 37 ° C tot een OD 600 van 0,5 (~ 5 x 10 8 cellen / ml). Groei zonder ampicilline vermijdt selectie tegen abnormaal of onproductieve replicatie tussenproducten die zich kunnen voordoen in een aantal mutanten. Bovendien, als met behulp van UV-licht om schade te veroorzaken, het verwijderen van de ampicilline van de media is nodig, omdat het absorbeert sterk op deze golflengten en schilden van de cellen, waardoor de effectieve dosis van UV.
- Werken onder gele lichten, is de cultuur in een 15 cm diameter petrischaal op een draaiend platform voor agitatie. Onze culturen zijn geplaatst op een afstand van een 15-watt kiemdodende lamp die een exposure van ~ 1 J/m2/sec, die wordt gemeten met behulp van een UVC fotometer produceert. Culturen worden bestraald met 50 J/m2 en dan meteen teruggeplaatst in de schudden 37 ° C incubator voor de duur van het experiment. Deze dosis produceert, gemiddeld genomen, een cyclobutaan pyrimidine dimeer elk 4,5 kb van ssDNA. De gele verlichting voorkomt fotoreactivering-omkering van cyclobutaan pyrimidine dimeren door photolyase.
2. DNA-isolatie.
- Op momenten dat replicatie tussenproducten moeten worden onderzocht, is een 0,75 ml van de cultuur geplaatst in 0,75 ml ijskoude NET30 buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 30 mM EDTA) en op ijs geplaatst tot het einde van het tijdsverloop. We hebben doorgaans een 90 minuten de tijd natuurlijk, met monsters onderzocht op 0, 15, 30, 45, 60 en 90 minuten. De EDTA-en koude temperaturen dienen om effectief te stoppen met replicatie-en nucleotide excisie reparatie.
- Elk monster wordt vervolgens gepelleteerd, geresuspendeerd in 150 pi van 1,5 mg / ml lysozym en 0,2 mg / ml RNaseA in TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA), en gelyseerd bij 37 ° C gedurende 20 minuten. Op dit moment zijn 10μl van proteïnase K (10mg/ml) en 10μl van 20% Sarkosyl toegevoegd en de incubatie wordt toegestaan om door te gaan gedurende 1 uur. Proteinase K en Sarkosyl helpen om DNA-fragmenten die kunnen worden geassocieerd met het membraan of eiwitten voor fenolextractie optreedt release. Omdat actief replicerende DNA is vaak gebonden aan eiwitten of membraan complexen, dit helpt bij het verhogen van de opbrengst van de replicatie fragmenten, die zijn teruggewonnen.
- Monsters worden vervolgens geëxtraheerd door toevoeging van 2 volumes van fenol aan elk monster en worden de buizen voorzichtig omgekeerd gedurende 5 minuten. Dan twee volumes van chloroform / isoamylalcohol (24 / 1) worden toegevoegd en worden de buizen voorzichtig weer omgekeerd gedurende 5 minuten.
- De monsters worden gecentrifugeerd bij 14.000 rpm in een microcentrifuge gedurende 5 minuten en de top waterige fase van elk monster wordt verwijderd, en geplaatst in een nieuwe buis. Dan vier volumes van chloroform / isoamylalcohol (24 / 1) worden toegevoegd, worden de buizen voorzichtig omgekeerd gedurende 5 minuten, en opnieuw gecentrifugeerd bij 14.000 rpm gedurende 5 minuten.
- De top, waterige fase in elk monster wordt vervolgens gedialyseerd gedurende 1 uur door het spotten van 100μl van elk monster op een 47mm Whatman 0,025 um porie-schijf die op 250 ml van 0.1X TE drijft in een bekerglas. Omdat replicerende structuren met enkele streng regio of branche punten zijn vatbaarder voor knippen, snijden we meestal onze pipetpunten af met een scheermesje om de mond breder en schuifkrachten te minimaliseren. In het algemeen moet pipetteren worden tot een minimum beperkt nadat het DNA werd gedigereerd met restrictie-enzymen.
- Elk monster wordt vervolgens gedigereerd met PvuII (New England Biolabs), die het plasmide linearizes net stroomafwaarts van de oorsprong van replicatie.
- Voorafgaand aan het laden in de agarose gel, 100μl chloroform en 20μl van 6X laden kleurstof die broomfenolblauw en Xyleen Cyanol bevat, zijn aan elk monster toegevoegd en gemengd. Vervolgens wordt 40μl van de waterige fase die het laden kleurstof geladen in de gel. Te minimaliseren structurele vooroordelen, structurele artefacten, en DNA scheren, betekent dit isolement procedure geen enkele maatregel te verrijken voor enkele streng regio's, neerslag, of concentraat van de DNA-monsters volgende cel lysis.
3. 2D-Gel-en Zuid-Analysis.
- De 2-dimensionale agarose-gel-analyse is gewijzigd van 3. Voor de 1e dimensie, zijn de beperkte DNA-monsters lopen door een 0,4% agarosegel in 1x TBE op 1V/cm. Een liter 10x TBE voorraad oplossing bevat:
- 108 g Tris Base
- 55 g boorzuur
- 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0)
- Een lambda Hind III size marker is geladen in de eerste baan, dan monsters worden geladen in elke andere baan. We hebben doorgaans de eerste dimension ~ 12-15 uur. Overslaan rijstroken maakt het gemakkelijker om de rijstroken slice uit te brengen in de tweede dimensie. De lage voltage en lage procent agarosegel dient te scheiden van de DNA-fragmenten in de eerste plaats op basis van grootte.
- Voor de tweede dimensie, zijn gel banen gesneden uit de eerste dimensie gel met een groot slagersmes. De eerste baan met de lambda Hind III-marker kan worden gekleurd met ethidiumbromide. Met behulp van de lambda Hind III marker als gids, bijsnijden en gooi de regio van de gel die lager is dan waar de gelineariseerde plasmide loopt naar verwachting. Onder deze omstandigheden, zien we dat gelineariseerde pBR322 loopt iets boven de xyleen cyanol vlek.
- Te werpen de tweede dimensie, is elke rijstrook horizontaal over de bovenkant van een lege gel caster. Een oplossing van 1,0% agarose in 1X TBE is bereid en gekoeld tot 55 ° C. Op dit moment is de gel-oplossing gegoten in de tweede dimensie cast, en zorg ervoor dat volledig bedekken van de gel plakjes. Zodra de gel heeft ingesteld, wordt het uit te voeren op 6.5V/cm in een elektroforese-eenheid die het mogelijk maakt de buffer te recirculeren. We hebben doorgaans de tweede dimensie ~ 5,5-7 uur. De hoge spanning en hoge procent agarosegel scheidt effectief het DNA-fragmenten op basis van hun vorm, evenals grootte. Niet-lineaire vormen lopen langzamer door de tweede dimensie.
- Na elektroforese, de gel wordt vervolgens gespoeld in H 2 O, tweemaal gewassen in 400 ml 0,25 M zoutzuur gedurende 15 minuten, gespoeld met H 2 O, en klik tweemaal op in 400 ml 0,4 M NaOH gewassen gedurende 30 minuten. Het zuur wast dienen om gedeeltelijk nick de DNA-moleculen in kleinere fragmenten die overdracht efficiënter. Deze stap is nodig vanwege de grote omvang en ongebruikelijke vormen van de DNA-replicatie tussenproducten.
- Het DNA in de gels wordt dan overgebracht naar een Hybond N + nylon membraan 4. We maken gebruik van een neerwaartse alkali transfersysteem met 0,4 miljoen NaOH. In het kort, zijn twee vellen vloeipapier gedrenkt in 0,4 M NaOH geplaatst op een grote stapel papieren handdoeken. Het nylon membraan is ook geweekt in 0,4 M NaOH en geplaatst op de top van het vloeipapier. De gel wordt vervolgens zorgvuldig lagen op de top van deze, gevolgd door een ander stuk vloeipapier, bevochtigd in de NaOH-oplossing. Ten slotte wordt een lang stuk nat vloeipapier lagen aan de bovenkant en de twee uiteinden zijn geplaatst in een keuken met een L van 0,4 miljoen NaOH-oplossing om te dienen als een lont. We meestal laten de DNA-overdracht voor 6-12 uur.
- Het nylon membraan wordt verwijderd, gewassen 20-30 sec in 5X SSC Buffer, en geplaatst in een hybridisatie roller fles met 10.5ml prehybridisatie Solution. Vervolgens wordt het membraan geïncubeerd bij 42 ° C met de rotatie van meer dan 6 uur. Prehybridisatie oplossing:
- 5,0 ml formamide
- 0,5 ml 20% SDS
- 2,5 ml 20x SSC *
- 2,0 ml 50X Denhardt's *
- 0,5 ml zalmsperma DNA (10mg/ml)
* Recepten voor SSC en Denhardt's zijn te vinden in 5
- Tijdens de prehybridisatie-periode, is 1 ug van plasmide pBR322 gelabeld met 32P door nick-translatie volgens het protocol geleverd door Roche met behulp van alfa label [32-P]-dCTP. Het radioactief gemerkte probe (100μl) wordt gedenatureerd door incubatie bij 98 ° C gedurende 10 minuten in een schroefdop microcentrifugebuis, en dan meteen op ijs geplaatst.
- De gedenatureerde probe wordt toegevoegd aan 5,9 ml hybridisatie-oplossing, die bevat:
- 3,0 ml formamide
- 1,5 ml SSC
- 1,0 ml H 2 O
- 0,15 ml 50X Denhardt's
- 0,10 ml 20% SDS
- 0,15 ml 10mg/ml zalmsperma DNA
- De prehybridisatie oplossing is uitgestort van de wals fles en de hybridisatie-oplossing wordt gegoten inch De rol fles wordt dan teruggestuurd naar de 42 ° C incubator en gedraaid voor meer dan 12 uur.
- De hybridisatie-oplossing is uitgestort van de wals fles. Daarna wordt de blot gewassen vier keer voor 20 minuten in de roller fles met ~ 150 ml van een oplossing die was 0.5X SSC, 0,1% SDS bij 42 ° C met rotatie.
- Na de laatste wasbeurt, wordt het membraan op een papieren handdoek tot de vloeistof is zichtbaar verdwenen. Het membraan wordt vervolgens verpakt in polyvinyl chloride-plasticfolie en blootgesteld aan een phosphorimager scherm. We visualiseren en kwantificeren van de radioactiviteit met behulp van een Storm 840 en de bijbehorende ImageQuant Software.
4. Representatieve resultaten:
Figuur 1. Plasmide replicatie tussenproducten waargenomen in de aanwezigheid en afwezigheid van UV-geïnduceerde DNA-schade. Het migratiepatroon van PvuII verteerd pBR322 plasmide waargenomen door 2D-agarose-gel analyse diagram. Niet-lineaire replicerende plasmiden uitgevoerd als een lineaire 4,4-kb fragment. Replicerende plasmiden vorm Y-vormige structuren die migreren langzamer dan de niet-replicerende fragmenten door hun grotere omvang en geennlinear vorm. Deze migratie patroon vormt een boog die zich uitstrekt van het lineaire gebied naar de put. Naar aanleiding van UV-bestraling, dubbel-Y of X-vormige moleculen worden waargenomen in de conus regio die langzamer migreert dan de boog van de Y-vormige moleculen. Een voorbeeld van de Zuid-analyse van de 2D-gel gemerkt met 32P-gelabeld pBR322 is aangetoond voor cellen onmiddellijk na UV-bestraling en 15 minuten na UV-bestraling (gereproduceerd met toestemming van de uitgever).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Typische resultaten van wild-type cellen in de aanwezigheid en afwezigheid van UV-geïnduceerde schade zijn weergegeven in figuur 1. Bij het ontbreken van schade, kan ~ 1% van de totale plasmide DNA te vinden in de Y-boog wanneer de cellen groeien snel in exponentiële fase. Na de bestraling, is een tijdelijke toename van Y-vormige moleculen waargenomen als geblokkeerd replicatie vorken zich ophopen aan beschadigd sites. De X-vormige replicatie tussenproducten ook tijdelijk ophopen en blijven bestaan totdat er een moment dat correleert met wanneer de letsels worden gerepareerd.
In plaats van de Southern analyse kan de replicatie tussenproducten worden geponst uit de gel met een plastic rietje, gezuiverd, en waargenomen direct met behulp van elektronenmicroscopie. We hebben gebruik gemaakt van deze aanpak met succes aan genproducten nodig is om replicatie vorken dat DNA-schade ontmoeting en abnormale replicatie tussenproducten die zich ophopen in deze mutanten te identificeren proces te identificeren. Bovendien kan deze aanpak eenvoudig worden aangepast om andere vormen van DNA-schade te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Werken in ons lab wordt ondersteund door LOOPBAAN award MCB0551798 van de National Science Foundation en het gebied te verlenen R15GM86839 van de NIGMS-NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer |
| 0.025 μm pore disks | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | Floating dialysis disks |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease |
| Nick-translation kit | Roche Group | 976776 | To make 32P-labeled probe |
| Blotting Paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | For Southern transfer |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli. Science. 299, 1064-1067 (2003).
- Friedman, K. L., Brewer, B. J. Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).
- Spivak, G., Hanawalt, P. C. Determination of damage and repair in specific DNA sequences. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A laboratory manual. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli. J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli. Genetics. 166, 1631-1640 (2004).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli. J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).
- Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest. J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli. Radiat Res. 168, 499-506 (2007).
- Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions. Mutat Res. 645, 19-26 (2008).
