Summary
Nous présentons une procédure par laquelle deux dimensions agarose gel d'analyse peuvent être utilisés pour identifier la structure des intermédiaires de réplication qui se produisent après irradiation UV.
Abstract
Réplication inexacte dans la présence de dommages à l'ADN est responsable de la majorité des réarrangements cellulaires et mutagenèse observée dans tous les types de cellules et est largement perçue comme étant directement associés au développement du cancer chez les humains. Dommages à l'ADN, telles que celle induite par une irradiation UV, altère sévèrement la capacité de réplication de dupliquer le modèle génomique précision. Un certain nombre de produits de gènes ont été identifiés qui sont nécessaires lorsque la réplication rencontres lésions de l'ADN dans le modèle. Toutefois, un défi reste a été de déterminer comment ces protéines lésions processus lors de la réplication
Protocol
1. La croissance et l'irradiation UV.
- 200 ul d'une culture fraîche nuit contenant le plasmide pBR322 cultivées en moyenne 1 Davis supplémenté en glucose 0,4%, 0,2% casaminoacides, et 10 pg / ml thymine (moyenne DGCthy) et 100 pg / ml ampicilline est granulé. Le culot cellulaire est ensuite remis en suspension dans un milieu de DGCthy 200 pl manquent à l'ampicilline et utilisées pour inoculer 20 ml de milieu DGCthy.
- Les cultures sont cultivées sans sélection à l'ampicilline dans un incubateur agitateur à 37 ° C à une DO 600 de 0,5 (~ 5 x 10 8 cellules / ml). La croissance sans ampicilline évite la sélection contre les intermédiaires de réplication anormale ou improductives qui peuvent survenir dans certains mutants. De plus, si vous utilisez la lumière UV à induire des lésions, la suppression de l'ampicilline par les médias est nécessaire car il absorbe fortement à ces longueurs d'onde et les cellules de boucliers, en réduisant la dose efficace des UV.
- Travaillant sous les lumières jaunes, la culture est placée dans une boîte de Pétri de diamètre 15cm sur une plateforme tournante pour l'agitation. Nos cultures sont placées à une distance d'une lampe de 15 watts qui produit des germicides un taux d'exposition de ~ 1 J/m2/sec, qui est mesurée à l'aide d'un photomètre UVC. Les cultures sont irradiées avec 50 J/m2 puis placé immédiatement en arrière dans le secouant à 37 ° C incubateur pour la durée de l'expérience. Cette dose produit, en moyenne, 1 cyclobutane pyrimidine dimère tous les 4,5 kb d'ADN simple brin. L'éclairage jaune empêche photoréactivation-inversion des dimères de pyrimidine cyclobutane par photolyase.
2. Isolation d'ADN.
- À l'époque où les intermédiaires de réplication sont à examiner, une aliquote de 0,75 ml de la culture est placée dans 0,75 ml de glace froide NET30 tampon (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 30 mM d'EDTA) et placé sur la glace jusqu'à la fin de le cours du temps. Nous généralement un cours de 90 minutes, avec des échantillons examinés à 0, 15, 30, 45, 60 et 90 minutes. L'EDTA et de la température froide servent à stopper efficacement la réplication et la réparation par excision de nucléotides.
- Chaque échantillon est ensuite granulé, remis en suspension dans 150 ul de 1,5 mg / ml de lysozyme et 0,2 mg / ml dans le RNaseA TE (10 mM Tris, pH 8,0, EDTA 1 mM), et lysées à 37 ° C pendant 20 min. A cette époque, 10 ul de la protéinase K (10mg/ml) et 10 pi de Sarkosyl 20% sont ajoutés et l'incubation est autorisé à continuer pendant 1 heure. Protéinase K et sarkosyl aider à libérer des fragments d'ADN qui peuvent être associés à la membrane ou de protéines avant l'extraction du phénol se produit. Comme l'ADN se répliquant activement est souvent lié à des complexes de protéines ou de la membrane, ce qui contribue d'augmenter le rendement des fragments de réplication qui sont récupérés.
- Les échantillons sont ensuite extraits par addition de 2 volumes de phénol pour chaque échantillon et les tubes sont délicatement inversé pendant 5 minutes. Puis 2 volumes de chloroforme / alcool isoamylique (24 / 1) sont ajoutés et les tubes sont à nouveau délicatement retourné pendant 5 minutes.
- Les échantillons sont centrifugés à 14000 rpm dans une microcentrifugeuse pendant 5 minutes et la phase aqueuse supérieure de chaque échantillon est retiré et placé dans un tube neuf. Puis 4 volumes de chloroforme / alcool isoamylique (24 / 1) sont ajoutés, les tubes sont délicatement inversé pendant 5 minutes, et de nouveau centrifugé à 14000 rpm pendant 5 minutes.
- Le haut, la phase aqueuse dans chaque échantillon est ensuite dialysée pendant 1 heure en repérant 100 ul de chaque échantillon sur un disque 47mm Whatman um 0,025 pores qui flotte sur 250 ml de 0,1 X TE dans un bécher. Parce que les structures répliquant avec des régions simple brin ou points de branchements sont plus sensibles au cisaillement, nous avons généralement coupés de nos embouts de pipette avec une lame de rasoir pour faire la bouche large et de minimiser les forces de cisaillement. En général, pipetage doit être maintenu au minimum jusqu'à ce que l'ADN a été digéré par les enzymes de restriction.
- Chaque échantillon est ensuite digéré par PvuII (New England Biolabs) qui linéarise le plasmide juste en aval de l'origine de réplication.
- Avant de charger dans le gel d'agarose, 100 ul de chloroforme et de 20 pi de colorant de chargement 6X qui contient bromophénol cyanol bleu et le xylène sont ajoutés à chaque échantillon et mélangés. Puis, 40μl de la phase aqueuse contenant le colorant de chargement est chargé dans le gel. Afin de minimiser les biais structurels, des artefacts de structure, et de cisaillement de l'ADN, cette procédure d'isolement ne comprend aucune mesure d'enrichir des régions simple brin, précipité, ou de concentrer les échantillons d'ADN après lyse cellulaire.
3. Gel 2D et Analyse du Sud.
- Les deux dimensions de gel d'agarose d'analyse est modifié à partir de 3. Pour la dimension 1ER, les échantillons d'ADN limités sont gérés via un gel d'agarose 0,4% en 1X TBE à 1V/cm. Un litre de solution stock de TBE 10X contient:
- 108 g de Tris base
- 55 g d'acide borique
- 40 ml d'EDTA 0,5 M (pH 8,0)
- Un marqueur de lambda Hind III de taille est chargé dans la voie d'abord, puis les échantillons sont chargés dans chaque autre voie. Nous fonctionnent généralement le premier dDIMENSION ~ 12-15 heures. Skipping voies rend plus facile à couper les voies de sortir de jeter dans la deuxième dimension. La basse tension et basse pour cent gel d'agarose permet de séparer les fragments d'ADN principalement basée sur la taille.
- Pour la deuxième dimension, les voies de gel sont tranchées de la première dimension du gel en utilisant un couteau de boucher de grande. La première voie contenant le marqueur de Hind III lambda peut être coloré avec du bromure d'éthidium. Utilisation du marqueur lambda Hind III comme un guide, des cultures et jeter la région du gel qui est ci-dessous où le plasmide linéarisé est prévu pour fonctionner. Dans ces conditions, nous constatons que pBR322 linéarisé tourne légèrement au-dessus du xylène cyanol tache.
- Pour lancer la deuxième dimension, chaque voie est placée horizontalement sur le sommet d'un lanceur de gel vide. Une solution de 1,0% d'agarose dans TBE 1X est préparé et refroidi à 55 ° C. A cette époque, la solution de gel est coulé dans de jeter la deuxième dimension, en veillant à recouvrir complètement les tranches de gel. Une fois que le gel a mis, il est exécuté au 6.5V/cm dans une unité d'électrophorèse, qui permet de faire circuler le tampon. Nous fonctionnent généralement la deuxième dimension de 5,5 à 7 heures ~. La haute tension et haute pour cent gel d'agarose sépare efficacement les fragments d'ADN en fonction de leur forme, ainsi que la taille. Formes non linéaires fonctionnent plus lentement dans la deuxième dimension.
- Après électrophorèse, le gel est ensuite rincé à l'H 2 O, lavé deux fois dans 400ml d'acide chlorhydrique à 0,25 M pendant 15 minutes, rincer avec H 2 O;, puis lavé à deux reprises dans 400 ml de NaOH 0,4 M pendant 30 minutes. L'acide lave servent partiellement Nick les molécules d'ADN en petits fragments que le transfert de façon plus efficace. Cette étape est nécessaire en raison de la grande taille et de formes inhabituelles de l'intermédiaires de réplication d'ADN.
- L'ADN dans les gels sont ensuite transférées à un Hybond N + membrane de nylon 4. Nous utilisons un système de transfert vers le bas alcalin avec 0,4 M NaOH. En bref, deux feuilles de papier buvard imbibé d'NaOH 0,4 M sont placés sur une grande pile de serviettes en papier. La membrane de nylon est également trempé dans NaOH 0,4 M et placé sur le dessus du papier buvard. Le gel est ensuite soigneusement couches sur le dessus de cela, suivi par un autre morceau de papier buvard humidifié dans la solution de NaOH. Enfin, un long morceau de papier buvard mouillé est posée sur le dessus et ses deux extrémités sont placées dans une des boîtes contenant 1 L de NaOH 0,4 M solution pour servir de mèche. En général, nous laisse le transfert d'ADN pour heures 6-12.
- La membrane de nylon est retirée, lavée 20-30 secondes dans du tampon SSC 5X, et placé dans un flacon roulant hybridation contenant solution de préhybridation 10.5ml. Ensuite, la membrane est incubée à 42 ° C avec une rotation de plus de 6 heures. Solution de préhybridation:
- 5,0 ml de formamide
- 0,5 ml SDS à 20%
- 2,5 ml 20X SSC *
- 2,0 ml 50X Denhardt *
- 0,5 ml d'ADN de sperme de saumon (10mg/ml)
Recettes * pour SSC et Denhardt peuvent être trouvés dans 5
- Pendant la période de pré-hybridation, 1 ug de plasmide pBR322 est marquée au 32P par translation de coupure selon le protocole fourni par alpha Roche utilisant étiquetés [32 P]-dCTP. La sonde radiomarquée (100 pi) est dénaturé par incubation à 98 ° C pendant 10 minutes dans un tube à centrifuger à vis, puis placé immédiatement sur la glace.
- La sonde dénaturée est ajouté à 5,9 ml solution d'hybridation, qui contient:
- 3,0 ml de formamide
- 1,5 ml SSC
- 1,0 ml H 2 O
- 0,15 ml 50X Denhardt
- 0,10 ml SDS à 20%
- 0,15 ml d'ADN de sperme de saumon 10mg/ml
- La solution de préhybridation est versé hors de la bouteille à rouleaux et la solution d'hybridation est versé po La bouteille rouleau est ensuite retourné à l'incubateur à 42 ° C et une rotation de plus de 12 heures.
- La solution d'hybridation est versé hors de la bouteille à rouleaux. Puis, la tache est lavée 4 fois pendant 20 minutes dans la bouteille à rouleaux avec ~ 150 ml d'une solution de lavage contenant 0.5X SSC, 0,1% SDS à 42 ° C avec rotation.
- Après le dernier lavage, la membrane est placée sur une serviette en papier jusqu'à ce que le liquide a visiblement disparu. La membrane est ensuite enveloppé dans une pellicule de plastique polychlorure de vinyle et exposés à un écran phosphorimager. Nous visualiser et de quantifier la radioactivité en utilisant un Storm 840 et son logiciel associé ImageQuant.
4. Les résultats représentatifs:
Figure 1. Intermédiaires de réplication plasmidique observée dans la présence et l'absence de dommages à l'ADN induites par les UV. Le schéma de migration des PvuII digérer le plasmide pBR322 observé par 2D-agarose gel de l'analyse est schématisé. Non-réplication des plasmides linéaires exécuté comme un linéaire de 4,4 kb de fragment. Réplication des plasmides forme en forme de Y structures qui migrent plus lentement que les fragments non répliquant en raison de leur grande taille et aucunenlinear forme. Ce modèle de migration forme un arc qui s'étend de la région linéaire vers le bien. Après irradiation UV, double-Y ou X-molécules en forme sont observées dans la région de cône qui migre plus lentement que l'arc de Y-forme des molécules. Un exemple de l'analyse Southern du gel 2D sondé avec marqué au 32P pBR322 est révélée pour des cellules immédiatement après l'irradiation UV et 15 minutes après l'irradiation UV (reproduit avec l'autorisation de l'éditeur).
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Discussion
Les résultats typiques obtenus à partir de cellules de type sauvage en présence et en absence de rayonnement UV-induite dégâts sont présentés dans la figure 1. En l'absence de dégâts, environ 1% de l'ADN plasmidique totale peut être trouvée dans l'arc Y lorsque les cellules sont en croissance rapide dans la phase exponentielle. Après irradiation, une augmentation transitoire de molécules en forme de Y est observé que les fourches de réplication bloquées s'accumuler aux sites endommagés. Les intermédiaires de réplication en forme de X aussi transitoirement s'accumuler et persister jusqu'à un moment qui corrèle avec lorsque les lésions sont réparées.
En lieu et place de l'analyse du Sud, les intermédiaires de réplication peuvent être découpées dans le gel avec une paille en plastique, purifié, et observés directement par microscopie électronique. Nous avons utilisé cette approche avec succès pour identifier les produits des gènes nécessaires au traitement de fourches de réplication qui rencontrent des dommages à l'ADN et d'identifier les intermédiaires de réplication anormales qui s'accumulent dans ces mutants. En outre, cette approche peut être facilement modifié afin d'examiner d'autres formes de dommages à l'ADN.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le travail dans notre laboratoire est soutenu par MCB0551798 bourse de carrière de la Fondation nationale des sciences et AREA octroi R15GM86839 du NIGMS-NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer |
| 0.025 μm pore disks | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | Floating dialysis disks |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease |
| Nick-translation kit | Roche Group | 976776 | To make 32P-labeled probe |
| Blotting Paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | For Southern transfer |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
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