Summary
Vi presenterar ett förfarande genom vilket tvådimensionella agarose-gel analys kan användas för att identifiera struktur replikering intermediärer som sker efter UV-bestrålning.
Abstract
Felaktiga replikering i närvaro av DNA-skador är ansvarig för huvuddelen av cellulära omorganiseringar och mutagenes observerats i alla celltyper och är allmänt anses vara direkt förknippade med utveckling av cancer hos människor. DNA-skador, till exempel sådan som orsakas av UV-strålning, försämrar kraftigt möjligheterna för replikering för att duplicera genomiska mallen korrekt. Ett antal genprodukter har identifierats som är nödvändiga vid replikering möten DNA-skador i mallen. Har dock en kvarstående utmaningen varit att avgöra hur dessa proteiner processen lesioner vid replikering
Protocol
1. Tillväxt och UV-strålning.
- 200μl av en färsk natten kultur som innehåller plasmiden pBR322 odlas i Davis medelstora 1 kompletteras med 0,4% glukos, 0,2% casamino syror och 10 mikrogram / ml tymin (DGCthy medium) och 100 mikrogram / ml ampicillin är pelleterat. Cellpelleten sedan suspenderade i 200μl DGCthy medelstora saknas ampicillin och används för att inokulera 20 ml DGCthy medium.
- Kulturer odlas utan ampicillin val i en skakande inkubator vid 37 ° C till en OD 600 på 0,5 (~ 5 x 10 8 celler / ml). Tillväxt utan ampicillin undviker val mot onormal eller improduktiv replikering intermediärer som kan uppstå i vissa mutanter. Dessutom, om du använder UV-ljus för att framkalla skada, är borttagning av ampicillin från media nödvändigt, eftersom den absorberar starkt vid dessa våglängder och skyddar cellerna, vilket minskar den effektiva dosen av UV.
- Arbetar under gult ljus är kulturen placeras i en 15 cm diameter petriskål på en roterande plattform för agitation. Våra kulturer är placerade på avstånd från en 15-watts bakteriedödande lampa som ger en exponering hastighet av ~ 1 J/m2/sec, vilket mäts med hjälp av en UVC-fotometer. Kulturer är bestrålade med 50 J/m2 och sedan placeras omedelbart tillbaka i skaka 37 ° C inkubator under hela experimentet. Denna dos ger i genomsnitt 1 cyclobutane pyrimidin dimer var 4,5 KB av ssDNA. Den gula belysningen förhindrar photoreactivation omkastning av dimers cyclobutane pyrimidin av photolyase.
2. DNA Isolation.
- I tider när replikering intermediärer skall undersökas, är en 0,75 ml alikvot av den kultur placeras i 0,75 ml iskall NET30 buffert (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 30 mM EDTA) och placeras på is fram till slutet av tiden kursen. Vi driver vanligtvis en 90 minuters tid naturligtvis med prover undersöks vid 0, 15, 30, 45, 60 och 90 minuter. Den EDTA och kyla tjänar till att effektivt stoppa replikering och nukleotid excision reparation.
- Varje prov är då pelleterat, suspenderade i 150 l av 1,5 mg / ml lysozym och 0,2 mg / ml RNaseA i TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) och lyseras vid 37 ° C i 20 minuter. Vid denna tid, är 10μl av proteinas K (10mg/ml) och 10μl 20% sarkosyl läggas till och inkubation får fortsätta i en timme. Proteinas K och sarkosyl hjälpa till att frigöra DNA-fragment som kan vara förknippade med membran eller proteiner före fenol utvinning sker. Eftersom aktivt replikera DNA är ofta bundna till protein eller membran komplex, hjälper detta öka utbytet av replikering fragment som återvinns.
- Proverna extraheras sedan genom att tillsätta 2 volymer av fenol till varje prov och rören försiktigt vändas i 5 minuter. Sedan två volymer av kloroform / Isoamyl alkohol (24 / 1) läggs till och rören försiktigt vändas igen, i 5 minuter.
- Proverna centrifugeras vid 14.000 rpm i mikrocentrifug i 5 minuter och den övre vattenfasen av varje prov tas bort och placeras i ett nytt rör. Sedan fyra volymer av kloroform / Isoamyl alkohol (24 / 1) läggs rören försiktigt vändas i 5 minuter, och centrifugeras igen vid 14.000 rpm i 5 minuter.
- Den översta, vattenfas i varje prov är då dialyseras under 1 timme med spotting 100μl av varje prov på en 47mm Whatman 0,025 ìm pore skiva som flyter på 250 ml 0,1 x TE i en bägare. Eftersom replikerar strukturer med sträng regioner eller förgreningar är mer mottagliga för klippning, skär vi vanligtvis våra pipettspetsar bort med ett rakblad för att göra mun bredare och minimera skjuvkrafter. I allmänhet bör pipettering hållas till ett minimum tills efter DNA har smält med restriktionsenzymer.
- Varje prov sedan kokas med PvuII (New England Biolabs) som linearizes plasmiden strax nedströms från startpunkten för replikation.
- Före lastning i agarosgel, 100μl kloroform och 20μl av 6X laddningsfärg som innehåller Bromfenolblått och xylen Cyanol tillsätts varje prov och blandat. Då är 40μl av vattenfasen som innehåller laddningsfärg laddas in gelen. För att minimera strukturella fördomar, strukturella artefakter, och DNA-klippning, innehåller denna isolering förfarande inte några åtgärder för att berika för sträng regioner, fällning, eller koncentrera DNA-prover efter cellslys.
3. 2D-gel och södra analys.
- Den 2-dimensionella agarose gel analys ändras från 3. För 1: a dimensionen, är de begränsade DNA-prover går genom en 0,4% agarosgel i 1x TBE på 1V/cm. En liter 10X TBE stamlösning innehåller:
- 108 g Tris Base
- 55 g borsyra
- 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0)
- En lambda Hind III storlek markör ligger i det första körfältet, då prover laddas i alla andra körfält. Vi kör vanligtvis det första dimension ~ 12-15 timmar. Hoppar banor gör det lättare att skiva körfält ut att kasta i den andra dimensionen. Det låg spänning och låg procent agarosgel tjänar till att separera DNA-fragment i första hand baseras på storlek.
- För den andra dimensionen, är gel körfält skivas ut från första dimensionen gelen med en stor slaktarkniv. Den första fil som innehåller lambda Hind III markör kan färgas med etidiumbromid. Med hjälp av lambda Hind III markör som guide, beskära och kasta den region i gel som nedan där det linjäriserade plasmiden väntas pågå. Under dessa förhållanden finner vi att linjäriserade pBR322 kör något över xylen cyanol fläcken.
- Att kasta den andra dimensionen är varje körfält placeras horisontellt längst upp i en tom gel caster. En lösning av 1,0% agaros i 1X TBE är beredd och kyls till 55 ° C. Vid denna tidpunkt är gellösningen strömmade in för att lägga den andra dimensionen, och se till att helt täcka gelen skivor. När gelen har satt, är det körs på 6.5V/cm i en elektroforesenhetens som tillåter buffert för att återcirkulera. Vi kör vanligtvis den andra dimensionen ~ 5,5-7 timmar. Den höga spänning och hög procent agarosgel separerar effektivt DNA-fragment baserat på deras form, samt storlek. Olinjära former köra långsammare genom den andra dimensionen.
- Efter elektrofores, gelen sedan sköljs i H 2 O, tvättas två gånger i 400ml 0,25 m saltsyra i 15 minuter, sköljas med H 2 O, och sedan tvättas två gånger i 400 ml 0,4 NaOH i 30 minuter. Syran tvättar syftar till att delvis nick DNA-molekyler i mindre fragment som överförs mer effektivt. Detta steg är nödvändigt på grund av den stora och ovanliga former av intermediärer DNA-replikation.
- DNA i gel överförs sedan till en Hybond N + nylon membran 4. Vi använder en nedåtgående alkali system för överföring med 0,4 NaOH. Kortfattat är två ark läskpapper indränkt i 0,4 NaOH placeras på en stor bunt med hushållspapper. Den nylon membran är också indränkt i 0,4 NaOH och placeras på toppen av läskpapper. Gelen är sedan försiktigt lager ovanpå detta, följt av en annan bit läskpapper fuktas i NaOH-lösningen. Slutligen är en lång bit fuktat läskpapper lager över toppen och dess två ändar placeras i en disk som innehåller 1 liter 0,4 NaOH-lösning att fungera som en veke. Vi låter normalt DNA-överföring för 6-12 timmar.
- Den nylon membran tas bort, tvättas 20-30 sek i 5X SSC Buffert och placeras i en hybridisering rulle flaska med 10.5ml Prehybridization Solution. Då är membranet inkuberas vid 42 ° C med rotation i mer än 6 timmar. Prehybridization lösning:
- 5,0 ml formamid
- 0,5 ml 20% SDS
- 2,5 ml 20X SSC *
- 2,0 ml 50X Denhardt s *
- 0,5 ml Lax spermiens DNA (10mg/ml)
* Recept för SSC och Denhardt s finns i 5
- Under prehybridization perioden är 1 mikrogram pBR322 plasmid märkta med 32P av Nick översättning enligt protokollet levereras av Roche med hjälp av alpha märkt [32-P]-dCTP. Den radioaktivt märkt probe (100μl) denatureras genom att inkubera vid 98 ° C i 10 minuter i ett skruvlock mikrocentrifugrör och sedan placeras omedelbart på is.
- Den denaturerade sond läggs till 5,9 ml hybridisering lösning, som innehåller:
- 3,0 ml formamid
- 1,5 ml SSC
- 1,0 ml H 2 O
- 0,15 ml 50X Denhardt s
- 0,10 ml 20% SDS
- 0,15 ml 10mg/ml Lax spermiens DNA
- Den prehybridization hälls ut ur rullen flaskan och hybridisering hälls i. rullen flaskan sedan tillbaka till 42 ° C inkubator och roteras för mer än 12 timmar.
- Den hybridisering hälls ut ur rullen flaskan. Sedan är det blot tvättas 4 gånger 20 minuter i berg-flaska med ~ 150 ml av en tvättlösning som innehåller 0,5 x SSC, 0,1% SDS vid 42 ° C med rotation.
- Efter den sista tvättningen, är membranet placeras på en pappershandduk tills vätskan har synbart försvunnit. Membranet är därefter insvept i PVC-klorid plastfolie och utsätts för en phosphorimager skärm. Vi visualisera och kvantifiera radioaktivitet med en Storm 840 och dess ImageQuant Software.
4. Representativa resultat:
Figur 1. Plasmid replikering intermediärer observerats i närvaro och frånvaro av UV-inducerade DNA-skador. Migrationen mönster PvuII rötas pBR322 plasmiden observerats av 2D-agarose gel analys är diagrammed. Icke-replikera linjära plasmider köras som en linjär 4,4-kb fragment. Replikera plasmider formen Y-formade strukturer som vandrar långsammare än den icke-replikera fragment på grund av sin större storlek och ingennlinear form. Denna migration mönster bildar en båge som sträcker sig ut från det linjära området mot brunnen. Efter UV-bestrålning, dubbel-Y eller X-formade molekyler observeras i konen region som vandrar långsammare än den båge av Y-formade molekyler. Ett exempel på den södra analys av 2D-gel sonderade med 32P-märkta pBR322 visas för cellerna omedelbart efter UV-strålning och 15 minuter efter UV-strålning (återges med tillstånd från förlaget).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Typiska resultat från vildtyps celler i närvaro och frånvaro av UV-inducerade skador visas i figur 1. I avsaknad av skada, kan ~ 1% av den totala plasmid-DNA finns i Y-båge när celler växer snabbt i exponentiell fas. Efter bestrålning, är en övergående ökning av Y-formade molekyler observeras som blockerade replikering gafflar samlas på skadade områden. X-formade replikering intermediärer också övergående ackumuleras och kvarstår tills en tid som korrelerar med när skador repareras.
I stället för den södra analys kan replikeringen intermediärer slås ut av gelen med en plast sugrör, renat och observeras direkt av elektronmikroskopi. Vi har använt denna metod framgångsrikt att identifiera genprodukter som krävs för att bearbeta replikering gafflar som stöter på DNA-skador och för att identifiera onormala replikering intermediärer som ackumuleras i dessa mutanter. Dessutom kan denna metod lätt ändras för att undersöka andra former av DNA-skador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbetet i vårt labb stöds av KARRIÄR utmärkelse MCB0551798 från National Science Foundation och området bevilja R15GM86839 från NIGMS-NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer |
| 0.025 μm pore disks | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | Floating dialysis disks |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease |
| Nick-translation kit | Roche Group | 976776 | To make 32P-labeled probe |
| Blotting Paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | For Southern transfer |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli. Science. 299, 1064-1067 (2003).
- Friedman, K. L., Brewer, B. J. Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).
- Spivak, G., Hanawalt, P. C. Determination of damage and repair in specific DNA sequences. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A laboratory manual. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli. J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli. Genetics. 166, 1631-1640 (2004).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli. J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).
- Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest. J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli. Radiat Res. 168, 499-506 (2007).
- Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions. Mutat Res. 645, 19-26 (2008).
