Summary
Nós apresentamos um procedimento pelo qual duas dimensões de análise agarose-gel pode ser usado para identificar a estrutura de intermediários de replicação que ocorrer após a irradiação UV.
Abstract
Replicação imprecisa na presença de danos no DNA é responsável pela maioria dos rearranjos celular e mutagênese observado em todos os tipos de células e é acreditado extensamente para ser diretamente associada ao desenvolvimento de câncer em seres humanos. Danos ao DNA, como a induzidas por radiação UV, severamente prejudica a capacidade de replicação para duplicar o modelo genômico com precisão. Uma série de produtos de genes foram identificados que são necessários quando a replicação de DNA encontros lesões no modelo. No entanto, um desafio restante foi para determinar como essas lesões proteínas processo durante a replicação
Protocol
1. Crescimento e irradiação UV.
- 200μl de uma cultura fresca durante a noite contendo o plasmídeo pBR322 cultivadas em Davis meio 1 suplementado com glicose 0,4%, 0,2% casamino ácidos, e 10 mcg / ml timina (médio DGCthy) e 100 mg / ml ampicilina é peletizada. O pellet celular é então ressuspenso em meio DGCthy 200μl falta ampicilina e usada para inocular 20 ml de meio de DGCthy.
- Culturas são cultivadas sem ampicilina seleção em uma incubadora de agitação a 37 ° C para um OD 600 de 0,5 (~ 5 x 10 8 células / ml). Crescimento sem ampicilina evita seleção contra intermediários de replicação anormal ou improdutivas que podem surgir em alguns mutantes. Além disso, se estiver usando luz UV para induzir a dano, a remoção da ampicilina da mídia é necessária, pois absorve fortemente nestes comprimentos de onda e escudos das células, reduzindo a dose efectiva de UV.
- Trabalhando sob luzes amarelas, a cultura é colocada em um prato de 15 centímetros de diâmetro Petri sobre uma plataforma giratória para agitação. Nossas culturas são colocados a uma distância de uma lâmpada germicida de 15 watts, que produz uma taxa de exposição de ~ 1 J/m2/sec, que é medida usando um fotômetro UVC. Culturas são irradiados com 50 J/m2 e depois colocado imediatamente de volta para a agitação 37 ° C incubadora para a duração do experimento. Esta dose produz, em média, um ciclobutano pirimidina dímero cada 4,5 kb de ssDNA. A iluminação amarela impede fotorreativação reversão de dímeros de pirimidina ciclobutano por fotoliase.
2. DNA Isolation.
- Às vezes, quando os intermediários de replicação devem ser examinados, uma alíquota de 0,75 ml da cultura é colocada em 0,75 ml de tampão de gelo NET30 frio (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 30 mM EDTA) e colocados no gelo até o final do o curso do tempo. Nós normalmente executam um curso de tempo 90 minutos, com amostras examinadas em 0, 15, 30, 45, 60 e 90 minutos. O EDTA e temperatura fria serve para efetivamente parar a replicação e reparação por excisão de nucleotídeos.
- Cada amostra é então peletizadas, ressuspenso em 150 mL de 1,5 mg / ml lisozima e 0,2 mg / ml RNaseA em TE (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA) e lisadas a 37 ° C por 20 min. Neste momento, 10μl de proteinase K (10mg/ml) e 10μl de sarkosyl 20% são adicionados e os de incubação é autorizado a continuar por 1 hr. Proteinase K e sarkosyl ajudar a liberar fragmentos de DNA que podem ser associados com a membrana ou proteínas antes da extração de fenol ocorre. Desde DNA ativamente replicando muitas vezes é obrigado a complexos de proteínas ou membrana, esta ajuda a aumentar o rendimento de fragmentos de replicação que são recuperados.
- Amostras são então extraídos pela adição de 2 volumes de fenol, para cada amostra e os tubos são gentilmente invertidos por 5 minutos. Em seguida, 2 volumes de clorofórmio / álcool isoamílico (24 / 1) são adicionados e os tubos são suavemente invertido uma vez por 5 minutos.
- As amostras são centrifugadas a 14.000 rpm em microcentrífuga por cinco minutos ea fase aquosa superior de cada amostra é retirada, e colocado em um novo tubo. Em seguida, 4 volumes de clorofórmio / álcool isoamílico (24 / 1) são adicionados, os tubos são gentilmente invertidos por 5 minutos, e centrifugadas novamente a 14.000 rpm por 5 minutos.
- A fase superior, aquosa de cada amostra é então dialisadas para 1 hora de spotting 100μl de cada amostra em um disco de 47 milímetros mM Whatman 0,025 poros que flutua em 250 ml de 0,1 x TE num copo. Porque as estruturas replicando com regiões único fio ou pontos de ramificação são mais suscetíveis ao corte, que normalmente cortam nossas dicas de pipeta fora com uma lâmina de barbear para fazer a boca mais larga e minimizar as forças de cisalhamento. Em geral, pipetagem deve ser reduzido ao mínimo até que o DNA foi digerido com enzimas de restrição.
- Cada amostra é então digerido com PvuII (New England Biolabs), que lineariza o plasmídeo apenas a jusante da origem de replicação.
- Antes de carregar no gel de agarose, clorofórmio e 100μl 20μl de corante que contém carga 6X Cyanol Bromofenol Azul e Xileno são adicionados a cada amostra e mistos. Então, 40μl da fase aquosa contendo o corante de carregamento é carregado no gel. Para minimizar os vieses estruturais, artefatos estruturais e corte de DNA, este procedimento de isolamento não inclui quaisquer medidas para enriquecer a regiões único fio, precipitado, ou concentrar as amostras de DNA após a lise celular.
3. Gel 2D e Análise do sul.
- O 2-dimensional análise agarose-gel é modificado a partir do 3. Para a dimensão 1 º, as amostras de DNA restrito são executados através de um gel de agarose 0,4% em TBE 1X em 1V/cm. Um litro de solução de TBE 10X de ações contém:
- 108 g Tris Base de Dados
- 55 g de ácido bórico
- 40 ml de EDTA 0,5 M (pH 8,0)
- A lambda marcador tamanho Hind III é carregado na pista primeiro, depois as amostras são carregadas em cada outra pista. Que normalmente executa o primeiro dimension ~ 12-15 hrs. Pular faixas torna mais fácil para cortar as pistas fora para lançar na segunda dimensão. A baixa tensão e baixo percentual de agarose gel serve para separar os fragmentos de DNA principalmente com base em tamanho.
- Para a segunda dimensão, pistas gel são cortados fora do gel primeira dimensão usando uma faca de açougueiro grandes. A primeira faixa que contém o marcador lambda III Hind pode ser corado com brometo de etídio. Usando o marcador lambda III Hind como um guia de culturas, e descartar a região do gel que é abaixo de onde o plasmídeo linearizado é esperado para ser executado. Sob essas condições, descobrimos que pBR322 linearizada corre ligeiramente acima da cyanol xileno mancha.
- Para lançar a segunda dimensão, cada faixa é colocada horizontalmente na parte superior de um gel caster vazio. A solução de agarose 1,0% em TBE 1X é preparado e resfriado a 55 ° C. Neste momento, a solução é derramado em gel para lançar a segunda dimensão, certificando-se cobrir completamente as fatias de gel. Uma vez que o gel tem definido, ele é executado no 6.5V/cm em uma unidade de eletroforese, que permite o buffer para recircular. Normalmente, executar a segunda dimensão ~ 5,5-7 horas. A alta tensão e alta cento agarose gel efetivamente separa os fragmentos de DNA com base em sua forma, assim como o tamanho. Formas não-lineares funcionar mais lentamente através da segunda dimensão.
- Eletroforese seguinte, o gel é então lavado em H 2 O, lavados duas vezes em 400ml de ácido clorídrico 0,25 m por 15 minutos, lavados com H 2 O;, e depois lavados duas vezes em 400 ml de NaOH 0,4 M por 30 minutos. O ácido lava servem para nick parcialmente as moléculas de DNA em fragmentos menores que a transferência de forma mais eficiente. Esta etapa é necessária devido ao grande tamanho e formas incomuns dos intermediários de replicação do DNA.
- O DNA no gel é então transferido para uma Hybond N + nylon membrana 4. Usamos um sistema de transferência para baixo alcalino com NaOH 0,4. Brevemente, duas folhas de papel mata-borrão embebido em NaOH 0,4 M são colocados em uma grande pilha de toalhas de papel. A membrana de nylon também é embebido em NaOH 0,4 M e colocado em cima do mata-borrão. O gel é então cuidadosamente em camadas no topo desta, seguido por um outro pedaço de papel mata-borrão, umedecidas na solução de NaOH. Finalmente, um longo pedaço de papel mata-borrão molhado é em camadas na parte superior e suas duas extremidades são colocadas em um prato com 1 L de solução de NaOH 0,4 M para servir como um pavio. Normalmente, deixe a transferência de DNA para 12/06 horas.
- A membrana de nylon é removido, lavado em 20-30 seg Buffer SSC 5X, e colocado em um frasco contendo solução de hibridização rolo Prehybridization 10.5ml. Então, a membrana é incubada a 42 ° C com rotação por mais de 6 horas. Solução Prehybridization:
- 5,0 ml formamida
- 0,5 ml SDS 20%
- 2,5 ml * 20X SSC
- * 2,0 ml de 50X Denhardt
- 0,5 ml de DNA de esperma de salmão (10mg/ml)
* Receitas para SSC e Denhardt pode ser encontrada em 5
- Durante o período prehybridization, 1 mg de pBR322 plasmídeo é marcado com 32P pela tradução nick acordo com o protocolo fornecido pela Roche alfa usando rotulados [32-P] dCTP-. A sonda marcada (100μl) é desnaturado pela incubação a 98 ° C por 10 minutos em um tubo de microcentrífuga com tampa de rosca, em seguida, colocada imediatamente no gelo.
- A sonda desnaturada é adicionado a 5,9 ml de solução de hibridização, que contém:
- 3,0 ml formamida
- 1,5 ml SSC
- 1,0 ml H 2 O
- 0,15 ml de 50X Denhardt
- 0,10 ml SDS 20%
- 0,15 ml 10mg/ml DNA do esperma de salmão
- A solução prehybridization é derramado da garrafa rolo ea solução de hibridação é derramado dentro A garrafa de rolo é então devolvido à 42 ° C incubadora e rodado por mais de 12hrs.
- A solução de hibridação é derramado da garrafa rolo. Então, o blot é lavado 4 vezes por 20 minutos na garrafa de rolo com ~ 150 ml de uma solução de lavagem contendo SSC 0,5 X, SDS 0,1% a 42 ° C com rotação.
- Após a última lavagem, a membrana é colocada em uma toalha de papel até que o líquido tem visivelmente desapareceu. A membrana é então envolto em cloreto de polivinil-plástico e expostos a uma tela phosphorimager. Nós visualizar e quantificar a radioatividade usando uma tempestade 840 e seu software associado ImageQuant.
4. Resultados representativos:
Figura 1. Intermediários de replicação do plasmídeo observada na presença e ausência de UV induzida por dano ao DNA. O padrão de migração de PvuII digerida pBR322 plasmídeo observado por 2D-agarose-gel análise é diagramado. Não-linear replicar plasmídeos executado como um fragmento de 4,4 kb linear. Plasmídeos replicar formulário em forma de Y estruturas que migram mais lento do que os fragmentos não-replicantes, devido à sua maior dimensão e nãoforma nlinear. Este padrão de migração formas um arco que se estende para fora da região linear para o bem. Após a irradiação UV, duplo Y ou X em forma de moléculas são observadas na região cone que migra mais lentamente do que o arco de Y em forma de moléculas. Um exemplo da análise do sul do gel 2D sondado com 32P-rotulados pBR322 é mostrado para as células imediatamente após a irradiação UV e 15 minutos após a irradiação UV (reproduzido com permissão do editor).
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Discussion
Resultados típicos obtidos a partir de células de tipo selvagem, na presença e ausência de UV induzida por danos são mostrados na Figura 1. Na ausência de danos, cerca de 1% do DNA total plasmídeo pode ser encontrado no arco Y quando as células estão crescendo rapidamente em fase exponencial. Após a irradiação, um aumento transitório no Y moléculas em forma é observado como garfos de replicação bloqueados acumular em locais danificados. Os intermediários em forma de X replicação também transitoriamente acumular e persistir até um tempo que se correlaciona com quando as lesões são reparadas.
No lugar da análise do Sul, os intermediários de replicação pode ser perfurado para fora do gel com um canudo de plástico, purificada e observados diretamente por microscopia eletrônica. Nós temos usado essa abordagem com sucesso para identificar produtos de genes necessários para processar garfos de replicação que encontro danos no DNA e identificar intermediários de replicação anormais que se acumulam nestes mutantes. Além disso, esta abordagem pode ser facilmente modificado para examinar outras formas de danos ao DNA.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Trabalho em nosso laboratório é apoiado pela concessão de CARREIRA MCB0551798 da National Science Foundation e conceder ÁREA R15GM86839 do NIGMS-NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer |
| 0.025 μm pore disks | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | Floating dialysis disks |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease |
| Nick-translation kit | Roche Group | 976776 | To make 32P-labeled probe |
| Blotting Paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | For Southern transfer |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
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