Visualizzazione dei raggi UV-indotta Intermedi replica in E. coli Utilizzando bidimensionale agarosio-gel Analisi

Sommario

Vi presentiamo una procedura che bidimensionale agarosio-gel analisi può essere utilizzato per identificare la struttura degli intermedi di replica che si verificano dopo irradiazione UV.

Abstract

Replica inesatte in presenza di danno al DNA è responsabile della maggior parte dei riarrangiamenti cellulare e mutagenesi osservato in tutti i tipi di cellule ed è ampiamente creduto di essere direttamente associati con lo sviluppo del cancro negli esseri umani. Danno al DNA, come quella indotta da radiazioni UV, limita fortemente la capacità di replicazione di duplicare il modello di genomica con precisione. Un certo numero di prodotti genici sono stati identificati, che sono necessari quando la replicazione incontra le lesioni del DNA nel modello. Tuttavia, una sfida che rimane è stato quello di determinare come queste lesioni processo di proteine ​​durante la replica

Protocollo

1. Crescita e di irradiazione UV.

1. 200μl di una cultura fresco durante la notte contenente il plasmide pBR322 cresciuto in media ¹ Davis integrato con 0,4% di glucosio, 0,2% di acidi casamino, e 10 mg / ml timina (media DGCthy) e 100 mg / ml ampicillina è pellet. Il pellet cellulare viene risospeso in medium DGCthy 200μl manca ampicillina e utilizzati per inoculare 20 ml di medium DGCthy.
2. Le culture sono cresciute senza selezione ampicillina in una agitazione incubatore a 37 ° C ad un diametro esterno ₆₀₀ di 0,5 (~ 5 x 10 ⁸ cellule / ml). Crescita senza ampicillina evita selezione contro intermedi replica anormale ....

Discussione

I risultati tipici ottenuti da cellule di tipo selvatico in presenza e in assenza di danno indotto dai raggi UV sono mostrati in figura 1. In assenza di danni, ~ 1% del DNA totale plasmide si possono trovare nell'arco Y quando le cellule sono in rapida crescita in fase esponenziale. A seguito di irradiazione, un aumento transitorio delle molecole a forma di Y si osserva come le forcelle replica bloccato accumulano nei siti danneggiati. La forma di X intermedi replica anche transitoriamente si accumulano e persistono.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Esempio di analisi Southern del gel 2D sottoposto a sonda	GE Healthcare	G15T8	Yellow Lighting
Lampada germicida da 15 μwatt	Sylvania	F20T12/GO	Lampada UV
Misuratore di intensità UV Blak-Ray 254 nm	Daigger	EF28195T	Fotometro UVC
Dischi con pori da 0,025 μm	Whatman, GE Healthcare	VSWP04700	Dischi per dialisi galleggianti
PvuII	Fermentas	ER0632	Endonucleasi di restrizione
Kit per la traduzione a nick	Roche Group	976776	Per ottenere una sonda marcata con 32P
Carta da trasferimento	Whatman, GE Healthcare	3030-704	Per il trasferimento Southern
Membrana in nylon	GE Healthcare	RPN203S	Per il trasferimento Southern