Summary
Vi presentiamo una procedura che bidimensionale agarosio-gel analisi può essere utilizzato per identificare la struttura degli intermedi di replica che si verificano dopo irradiazione UV.
Abstract
Replica inesatte in presenza di danno al DNA è responsabile della maggior parte dei riarrangiamenti cellulare e mutagenesi osservato in tutti i tipi di cellule ed è ampiamente creduto di essere direttamente associati con lo sviluppo del cancro negli esseri umani. Danno al DNA, come quella indotta da radiazioni UV, limita fortemente la capacità di replicazione di duplicare il modello di genomica con precisione. Un certo numero di prodotti genici sono stati identificati, che sono necessari quando la replicazione incontra le lesioni del DNA nel modello. Tuttavia, una sfida che rimane è stato quello di determinare come queste lesioni processo di proteine durante la replica
Protocol
1. Crescita e di irradiazione UV.
- 200μl di una cultura fresco durante la notte contenente il plasmide pBR322 cresciuto in media 1 Davis integrato con 0,4% di glucosio, 0,2% di acidi casamino, e 10 mg / ml timina (media DGCthy) e 100 mg / ml ampicillina è pellet. Il pellet cellulare viene risospeso in medium DGCthy 200μl manca ampicillina e utilizzati per inoculare 20 ml di medium DGCthy.
- Le culture sono cresciute senza selezione ampicillina in una agitazione incubatore a 37 ° C ad un diametro esterno 600 di 0,5 (~ 5 x 10 8 cellule / ml). Crescita senza ampicillina evita selezione contro intermedi replica anormale o improduttivi che possono sorgere in alcuni mutanti. Inoltre, se si utilizza la luce UV per indurre danni, la rimozione del ampicillina da parte dei media è necessario perché assorbe fortemente a queste lunghezze d'onda e scudi le cellule, riducendo la dose efficace di UV.
- Lavorare sotto le luci gialle, la cultura è posto in un piatto di 15 centimetri di diametro Petri su una piattaforma rotante per l'agitazione. Le nostre culture sono posti ad una distanza da un 15-watt lampada germicida che produce un tasso di esposizione di circa 1 J/m2/sec, che viene misurata con un fotometro UVC. Le culture sono irradiati con 50 J/m2 e poi messo immediatamente in agitazione i 37 ° C incubatore per tutta la durata dell'esperimento. Questa dose produce, in media, 1 ciclobutano dimero pirimidina ogni 4,5 kb di ssDNA. La luce gialla impedisce fotoriattivazione-inversione di dimeri pirimidinici ciclobutano da fotoliasi.
2. Isolamento del DNA.
- A volte, quando intermedi replica sono da esaminare, una aliquota 0,75 ml di cultura viene inserito in 0,75 ml di ghiaccio freddo NET30 Buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0, 30 mM EDTA) e messo in ghiaccio fino alla fine del la durata del corso. Noi di solito un decorso di tempo 90 minuti, con i campioni esaminati a 0, 15, 30, 45, 60 e 90 minuti. L'EDTA e la temperatura fredda servono a bloccare efficacemente la replicazione e riparazione per escissione dei nucleotidi.
- Ogni campione è poi pellet, risospeso in 150 ml di 1,5 mg / ml di lisozima e 0,2 mg / ml RNaseA a TE (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA), e lisato a 37 ° C per 20 min. In questo momento, 10μl di proteinasi K (10 mg) e 10μl del 20% sarkosyl sono aggiunti e l'incubazione è permesso di proseguire per 1 ora. Proteinasi K e sarkosyl aiutare a liberare frammenti di DNA che possono essere associati con la membrana o proteine di prima estrazione fenolo si verifica. Dal DNA replicazione attiva è spesso legato a complessi proteici o membrana, questo aiuta ad aumentare la resa di frammenti di replica che sono recuperati.
- I campioni vengono poi estratti con l'aggiunta di 2 volumi di fenolo per ogni campione e i tubi sono capovolta con cautela per 5 minuti. Quindi 2 volumi di cloroformio / alcool isoamilico (24 / 1) sono aggiunte ei tubi sono capovolta con cautela per 5 minuti.
- I campioni vengono centrifugati a 14.000 rpm in una microcentrifuga per 5 minuti e la fase acquosa superiore di ogni campione è stato rimosso, e collocato in una nuova provetta. Poi 4 volumi di cloroformio / alcool isoamilico (24 / 1) sono aggiunti, i tubi sono capovolta con cautela per 5 minuti, e centrifugato di nuovo a 14.000 rpm per 5 minuti.
- Il piano, in fase acquosa ogni campione viene poi dializzati per 1 ora di spotting 100μl di ciascun campione su un disco Whatman 47 millimetri 0,025 micron pori che galleggia su 250 ml di 0,1 X. TE in un bicchiere. Perché le strutture replicare con le regioni singolo filamento o punti di ramificazione sono più sensibili al taglio, di solito tagliare le nostre puntali con una lama di rasoio per rendere la bocca più ampia e minimizzare forze di taglio. In generale, pipettaggio dovrebbero essere ridotte al minimo fino a dopo il DNA è stato digerito con enzimi di restrizione.
- Ogni campione viene digerito con PvuII (New England Biolabs) che linearizza il plasmide appena a valle l'origine di replicazione.
- Prima di caricare nel gel di agarosio, 100μl cloroformio e 20μl di colorante di caricamento 6X che contiene bromofenolo Cyanol Blu e xilene sono aggiunti ad ogni campione e misti. Poi, 40μl della fase acquosa contenente il colorante di caricamento viene caricata nel gel. Per ridurre al minimo i pregiudizi strutturali, manufatti strutturali, e di taglio del DNA, questa procedura di isolamento non prevede alcuna misura per arricchire per le regioni singolo filamento, precipitare, o concentrato i campioni di DNA segue la lisi cellulare.
3. Gel 2D e analisi del sud.
- Il 2-dimensionale agarosio-gel analisi viene modificato da 3. Per la dimensione 1 °, i campioni di DNA ristretto vengono eseguiti attraverso un gel di agarosio 0,4% in TBE 1X a 1V/cm. Un litro di soluzione di TBE 10X magazzino contiene:
- 108 g Tris Base
- 55 g di acido borico
- 40 ml di EDTA 0,5 M (pH 8,0)
- Un Hind lambda marcatore dimensioni III è caricato nel vicolo, poi i campioni sono stati caricati in ogni altra corsia. Noi di solito eseguire il primo dimension ~ 12-15 ore. Salto di corsia rende più semplice per tagliare fuori le corsie di lanciare nella seconda dimensione. La bassa tensione e bassa percentuale gel serve per separare i frammenti di DNA in primo luogo sulla base delle dimensioni.
- Per la seconda dimensione, corsie gel sono fette fuori del gel prima dimensione usando un coltello da macellaio di grande. Prima corsia contenente il marcatore lambda Hind III possono essere colorati con bromuro di etidio. Utilizzando il lambda marcatore Hind III come coltura guida, e scartare la regione del gel che è al di sotto dove il plasmide linearizzato è previsto per l'esecuzione. In queste condizioni, troviamo che pBR322 linearizzato corre leggermente al di sopra del cyanol xilene macchia.
- Per lanciare la seconda dimensione, ogni corsia è posto orizzontalmente nella parte superiore di un gel caster vuoto. Una soluzione di 1,0% di agarosio in TBE 1X è preparato e raffreddato a 55 ° C. A questo punto, la soluzione gel viene versato per lanciare la seconda dimensione, avendo cura di coprire completamente le fette di gel. Una volta che il gel ha creato, è gestito in 6.5V/cm in una unità di elettroforesi che permette il buffer di ricircolo. Noi di solito eseguire la seconda dimensione ~ 5,5-7 ore. L'alta tensione e alta cento gel separa in modo efficace i frammenti di DNA in base alla loro forma, così come le dimensioni. Forme non lineari eseguire più lentamente attraverso la seconda dimensione.
- A seguito di elettroforesi, il gel viene poi sciacquato in H 2 O, lavate due volte in 400 ml di acido cloridrico 0.25M per 15 minuti, sciacquati con H 2 O, e quindi lavato due volte in 400 ml di NaOH 0.4M per 30 minuti. L'acido lava servono a parzialmente nick le molecole di DNA in frammenti più piccoli che il trasferimento in modo più efficiente. Questo passaggio è necessario a causa delle grandi dimensioni e forme insolite di intermedi replicazione del DNA.
- Il DNA nel gel viene poi trasferito in un Hybond N + membrana di nylon 4. Usiamo un sistema di trasferimento verso il basso alcali con NaOH 0.4M. In breve, due fogli di carta assorbente imbevuta di 0.4M NaOH sono disposti su un grande pila di tovaglioli di carta. La membrana di nylon è anche intriso di NaOH 0.4M e posto sulla parte superiore della carta assorbente. Il gel viene poi accuratamente a strati in cima a questa, seguita da un altro pezzo di carta assorbente, bagnato nella soluzione di NaOH. Infine, un lungo pezzo di carta assorbente bagnata è stratificato nella parte superiore e le sue due estremità sono posti in una specialità contenente 1 L di soluzione 0.4M di NaOH a servire come uno stoppino. Noi di solito lasciare che il trasferimento del DNA per ore 6-12.
- La membrana di nylon è stato rimosso, lavato 20-30 secondi a 5X Buffer SSC, e messo in una bottiglia rullo ibridazione contenente soluzione 10.5ml Prehybridization. Poi, la membrana viene incubata a 42 ° C con rotazione per più di 6 ore. Prehybridization soluzione:
- 5,0 ml formamide
- 0,5 ml 20% SDS
- 2,5 ml 20X SSC *
- * 2,0 ml di 50X Denhardt
- 0,5 ml di sperma DNA Salmon (10mg/ml)
* Ricette per SSC e Denhardt si possono trovare in 5
- Durante il periodo prehybridization, 1 mg di plasmide pBR322 è marcato con 32P dalla traduzione nick secondo il protocollo fornito da alfa Roche utilizzando l'etichetta [32 P]-dCTP. La sonda radiomarcata (100μl) è denaturato incubando a 98 ° C per 10 minuti in una provetta tappo a vite, e poi messo immediatamente in ghiaccio.
- La sonda denaturato viene aggiunta a 5,9 ml di soluzione di ibridazione, che contiene:
- 3,0 ml formamide
- 1,5 ml SSC
- 1,0 ml H 2 O
- 0,15 ml di 50X Denhardt
- 0,10 ml 20% SDS
- 0,15 ml 10mg/ml Salmone DNA dello sperma
- La soluzione prehybridization viene versata dalla bottiglia rullo e la soluzione di ibridazione viene versata in bottiglia Il rullo viene quindi restituito ai 42 ° C incubatore e ruotato per più di 12h.
- La soluzione di ibridazione viene versata dalla bottiglia rullo. Poi, la macchia è lavata 4 volte per 20 minuti in bottiglia rullo con circa 150 ml di una soluzione di lavaggio contenente 0.5X SSC, 0,1% SDS a 42 ° C con rotazione.
- Dopo l'ultimo lavaggio, la membrana è posta su un tovagliolo di carta fino a quando il liquido è visibilmente scomparso. La membrana viene poi avvolto in polivinile cloruro di pellicola trasparente e esposti a uno schermo phosphorimager. Noi visualizzare e quantificare la radioattività utilizzando una tempesta 840 e il suo software associati ImageQuant.
4. Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Intermedi di replicazione plasmide osservato in presenza e in assenza di raggi UV-indotto danni al DNA. Il modello migratorio di PvuII digerito pBR322 plasmide osservato da 2D-gel di agarosio-analisi è diagramma. Plasmidi lineari non replicare eseguito come lineare da 4,4 kb frammento. Plasmidi replicare forma ad Y strutture che migrano più lentamente i frammenti a causa della loro maggiore dimensione non replicare e nonforma nlinear. Questo modello migratorio forma un arco che si estende fuori dalla regione lineare verso il pozzo. In seguito a irradiazione UV, doppia-Y o X a forma di molecole sono osservate nella regione del cono che migra più lentamente l'arco a forma di Y molecole. Un esempio di analisi del sud del gel 2D sondato con marcato con 32P pBR322 è indicato per le cellule immediatamente dopo l'irradiazione UV e 15 minuti dopo l'irradiazione UV (riprodotto con il permesso dell'editore).
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Discussion
I risultati tipici ottenuti da cellule di tipo selvatico in presenza e in assenza di danno indotto dai raggi UV sono mostrati in figura 1. In assenza di danni, ~ 1% del DNA totale plasmide si possono trovare nell'arco Y quando le cellule sono in rapida crescita in fase esponenziale. A seguito di irradiazione, un aumento transitorio delle molecole a forma di Y si osserva come le forcelle replica bloccato accumulano nei siti danneggiati. La forma di X intermedi replica anche transitoriamente si accumulano e persistono fino ad un tempo che mette in relazione con se le lesioni sono riparate.
Al posto dell'analisi del Sud, gli intermedi replica può essere perforato del gel con una cannuccia di plastica, purificata, e osservare direttamente al microscopio elettronico. Abbiamo usato questo metodo con successo per identificare i prodotti genici necessari per elaborare forche replica che incontro danni al DNA e per identificare gli intermedi replica anomale che si accumulano in questi mutanti. Inoltre, questo approccio può essere facilmente modificato per esaminare altre forme di danno al DNA.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Lavoro nel nostro laboratorio è supportato da premio CARRIERA MCB0551798 dalla National Science Foundation e AREA concedere R15GM86839 dal NIGMS-NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer |
| 0.025 μm pore disks | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | Floating dialysis disks |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease |
| Nick-translation kit | Roche Group | 976776 | To make 32P-labeled probe |
| Blotting Paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | For Southern transfer |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
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