Summary
इस प्रोटोकॉल पीटा एसआर cryopreservation के मध्यम में मानव आईपीएस कोशिकाओं cryopreserving और पूरा पीटा एसआर फीडर मुफ्त (KSR - एफएफ) मध्यम या आधारित फीडर पीटा एसआर मध्यम में इन कोशिकाओं को ठीक करने के लिए विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करता है.
Abstract
2006 में खोज की है कि मानव और माउस fibroblasts आईपीएस कोशिकाओं उल्लेखनीय भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के समान गुणों के साथ 1-3 उत्पन्न करने के लिए reprogrammed किया जा सकता है सेल थेरेपी, दवाओं की खोज, और बुनियादी अनुसंधान के लिए pluripotent कोशिकाओं की एक मूल्यवान नए स्रोत पैदा कर दी है.
GIBCO मीडिया और अभिकर्मकों pluripotent स्टेम सेल अनुसंधान के मामले में सबसे आगे साल के लिए किया गया है. नॉकआउट DMEM नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट के साथ पूरक पसंद के भ्रूण स्टेम सेल के विकास और अब आईपीएस कोशिका 3-9 संस्कृति के लिए मीडिया है . यह सोने के मानक मीडिया प्रणाली अब नॉकआउट एसआर ग्रोथ फैक्टर कॉकटेल के अलावा के साथ फीडर मुक्त संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
पारंपरिक मानव ES और आईपीएस सेल संस्कृति तरीके माउस या मानव fibroblast फीडर परतों का उपयोग, या फीडर वातानुकूलित माध्यम की आवश्यकता होती है. ये संस्कृति तरीकों श्रम प्रधान, पैमाने पर करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं और यह कूल्हों undifferentiated कोशिकाओं अपरिभाषित शर्तों की वजह से बनाए रखने के लिए मुश्किल है. Invitrogen नॉकआउट एसआर ग्रोथ फैक्टर कॉकटेल विकसित किया गया है आप आसानी से अपने कूल्हों और HES सेल संस्कृतियों संक्रमण फीडर से मुक्त करने की अनुमति है जबकि अभी भी नॉकआउट एसआर के आपके उपयोग को बनाए रखने.
Protocol
नोट: बाँझ संस्कृति स्थिति बनाए रखने के लिए, इस प्रोटोकॉल में सभी प्रक्रियाओं के बाहर किया जाता है बाँझ प्रयोगशाला प्रथाओं का उपयोग और एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत आयोजित की.
पहले शुरू, यह सुनिश्चित है कि किसी भी मीडिया 37 के लिए equilibrated है डिग्री सेल्सियस और उचित मार डाला.
Geltrex लेपित संस्कृति व्यंजन की तैयारी
नोट: CELLstart लेपित संस्कृति व्यंजन का उपयोग करने के लिए परिशिष्ट देखें.
- पिघलना 2-8 धीरे धीरे Geltrex ° सी (1 एमएल) की एक ट्यूब और D-MEM/F-12 नॉकआउट के 99 एमएल में 1:100 पतला. धीरे समाधान मिक्स.
नोट: कुछ आईपीएस कोशिका लाइनों इष्टतम विकास के लिए एक अलग Geltrex कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है. वैकल्पिक dilutions के लिए परिशिष्ट देखें. - Geltrex समाधान (35 मिमी के लिए एक डिश 1 एमएल, 60 मिमी के लिए एक डिश 1.5 एमएल) के साथ प्रत्येक पकवान संस्कृति की पूरी सतह को कवर.
- Parafilm साथ प्रत्येक पकवान सुखाने को रोकने के लिए और 37 पर 1 घंटे के लिए व्यंजन सेते डिग्री सेल्सियस सील
नोट: इस बिंदु पर आप 4 ° C में Geltrex लेपित संस्कृति बर्तन की दुकान करने के लिए 1 महीने के लिए लिए हो सकता है. Parafilm साथ प्रत्येक पकवान सील Geltrex बाहर सुखाने से रोकने के. - का उपयोग करने के लिए पहले, एक लामिना का प्रवाह हुड Geltrex लेपित व्यंजन हस्तांतरण और उन्हें कमरे के तापमान (लगभग 1 घंटे) को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं.
पूरा पीटा SR-फीडर मुफ्त मध्यम की तैयारी
- 10 μg / एमएल मूल FGF समाधान के 1 एमएल तैयार करने के लिए, aseptically नीचे सूचीबद्ध घटकों के मिश्रण. विभाज्य समाधान और -20 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 6 महीने के लिए दुकान.
बेसिक FGF 10 μg D-पीबीएस 990μL 10% BSA 10 μL
नोट: BSA HSA या एक ही एकाग्रता में नॉकआउट एसआर के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है है. - 2 मिलीग्राम / एमएल Dispase समाधान के 50 एमएल तैयार करने के लिए, aseptically नीचे सूचीबद्ध घटकों के मिश्रण. बाँझ समाधान और 4 बजे दुकान ° सी अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए फ़िल्टर.
Dispase 100 मिलीग्राम D-पीबीएस 50 एमएल - पूरा पीटा एसआर के 100 एमएल तैयार फीडर मुफ्त (KSR - एफएफ) aseptically नीचे तालिका में सूचीबद्ध घटकों गठबंधन.
घटक शेयर एकाग्रता अंतिम एकाग्रता आयतन DMEM/F12 नॉकआउट (Cat. नहीं. 12660-012) - 1X 76.8 एमएल GlutaMAX मैं (Cat. 35050-061 सं.) 200 मिमी 2 मिमी 1 एमएल पीटकर एसआर (Cat. नहीं. 10828-028) - 20% 20 एमएल एसआर GFC (Cat. कोई A10580-01.) पीटा 50X 1X 2 एमएल bFGF (Cat. नहीं. PHG0024). 10 μg / एमएल 20 एनजी / एमएल 200 μL
आप 2-8 ° सी में KSR - एफएफ मध्यम स्टोर एक सप्ताह के लिए हो सकता है. - बस से पहले तापमान और गैसों को पूरा मध्यम पूर्व equilibrating, aseptically 2 mercaptoethanol के लिए आवश्यक मात्रा (55 मिमी शेयर एकाग्रता) एक 0.1 मिमी अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ सकते हैं . उदाहरण के लिए, KSR एफ के 100 एमएल तैयार करने के लिएएफ मध्यम 55 मिमी mercaptoethanol 2 (1:550 कमजोर पड़ने) वैकल्पिक रूप से 182 μL जोड़ने के लिए, 2 mercaptoethanol 1X पूरा माध्यम से जोड़ा जा सकता है और एक सप्ताह के लिए 2-8 ° सी में संग्रहीत.
बर्फ़ीली / cryopreservation मध्यम की तैयारी
cryopreservation मध्यम दो मीडिया के होते हैं, बर्फ़ीली मध्यम एक और बर्फ़ीली मध्यम बी वे अलग अलग समय पर कक्षों के लिए जोड़ रहे हैं और अलग रहना चाहिए. वे एक cryopreservation मध्यम की कुल मात्रा का 50% की जरूरत है. cryopreservation की जरूरत मध्यम की कुल मात्रा प्रत्येक शीशी के लिए जमे हुए किया जा के लिए 1 एमएल है. एक 90% hESC मिला हुआ 60mm पकवान बैंक cryopreservation मीडिया में 2 hESC की शीशियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
प्रत्येक बर्फ़ीली मध्यम की पर्याप्त मात्रा के साथ एक अतिरिक्त 2 5ml व्यय सुनिश्चित करने के लिए तैयार है.
| बर्फ़ीली मध्यम ए (अंतिम मात्रा का 50%): | 50 DMEM/F12% | 50% KSR |
| बर्फ़ीली मध्यम बी (अंतिम मात्रा का 50%): | 80 DMEM/F12% | 20% DMSO |
उदाहरण:
यदि आप कक्षों की 20 शीशियों ठंड रहे हैं, आप cryopreservation मध्यम के 20ml की आवश्यकता होगी. 24mL cryopreservation मध्यम की कुल के लिए व्यय के लिए 4mL जोड़ें. इसका मतलब है कि आप बर्फ़ीली मध्यम के 12mL की आवश्यकता होगी (24mL का 50%) और बर्फ़ीली मध्यम बी (24mL का 50%) के 12mL.
| बर्फ़ीली मध्यम (12 एमएल): | 6 एमएल DMEM/F12 | 6 एमएल KSR |
| बर्फ़ीली मध्यम बी (12 एमएल): | 9.6 एमएल DMEM/F12 | 2.4 एमएल DMSO |
cryopreservation मध्यम के अंतिम संरचना 65% DMEM/F12, KSR 25%, और 10% DMSO है.
Cryopreserving IPSCs
- पूर्व एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म Dispase के लिए आवश्यक मात्रा. आवश्यक मात्रा पर जानकारी के लिए नीचे एक टेबल के लिए संदर्भ लें.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान for15 मिनट में KSR - एफएफ के लिए आवश्यक मात्रा पूर्व संतुलित. आवश्यक मात्रा पर जानकारी के लिए तालिका 1below देखें.
- संस्कृति एक विंदुक का उपयोग पोत से खर्च मध्यम Aspirate, और कोशिकाओं डी पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला.
- धीरे संस्कृति पोत (उदाहरण के लिए, 60 मिमी संस्कृति डिश प्रति Dispase समाधान के 1 एमएल) के लिए पूर्व गर्म Dispase समाधान जोड़ें. पूरे कोशिका की सतह कोट संस्कृति पोत भंवर.
- 37 ° C पर 3 मिनट के लिए संस्कृति पोत सेते हैं.
- इनक्यूबेटर से पोत निकालें, Dispase समाधान aspirate, और धीरे डी पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो.
- धीरे बंद संस्कृति एक सेल खुरचनी का उपयोग पकवान की सतह कोशिकाओं खुरचना, और एक बाँझ 15ml अपकेंद्रित्र ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण.
- संस्कृति डिश KSR - एफएफ के साथ दो बार, कुल्ला धीरे "बंद छिड़काव" किसी भी कोशिकाओं है कि अलग नहीं है. पूल 15ml ट्यूब में कोशिकाओं के साथ मध्यम कुल्ला.
- XG 200 पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गोली कोशिकाओं को ट्यूब अपकेंद्रित्र.
- ध्यान से सेल गोली परेशान बिना aspirate सतह पर तैरनेवाला और इसे त्यागने.
- Cryovials की पर्याप्त मात्रा में तैयार. एक बार कोशिकाओं DMSO के साथ संपर्क में हैं, वे और aliquoted होना चाहिए 2-3 मिनट के भीतर जमे हुए.
- धीरे से झटका ट्यूब, पूरी तरह से ट्यूब नीचे से सेल गोली बेदखल और [धीरे से ऊपर और नीचे pipetting एक 5 एमएल सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करके] बर्फ़ीली मध्यम ए में कोशिकाओं फिर से निलंबित. Clumps की वर्दी निलंबन के बाद, यह करने के लिए बर्फ़ीली मध्यम बी के बराबर मात्रा में जोड़ने के लिए, एक बूंद बुद्धिमान तरीके से, जबकि धीरे मिश्रण करने के लिए सेल निलंबन घूमता.
नोट: इस बिंदु पर, कक्षों DMSO के साथ संपर्क में हैं, और काम कुशलता से किया जाना चाहिए. एक बार कोशिकाओं DMSO के साथ संपर्क में हैं, वे और aliquoted होना चाहिए 2-3 मिनट के भीतर जमे हुए. - विभाज्य प्रत्येक cryovial में 1 सेल निलंबन के मिली.
- जल्दी जगह शीशियों में श्री ठंढा [तेजी से फ्रीज] और यह -80 डिग्री सेल्सियस रातोंरात हस्तांतरण.
- ° सी -80 पर रात में भंडारण के बाद, लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक तरल नाइट्रोजन टैंक कोशिकाओं हस्तांतरण.
iPSC शीशी पिघलना और सेल वसूली
नोट: KSR एफएफ KSR युक्त मध्यम MEF वातानुकूलित, या भक्षण के साथ उपयोग के लिए KSR मध्यम के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है. मीडिया की तैयारी के लिए निर्देशों के लिए परिशिष्ट देखें.
50 एमएल ट्यूब में पूर्व गर्म KSR - एफएफ मध्यम 10ml.
- कमरे के तापमान पर Geltrex - लेपित व्यंजन का उचित मात्रा में संतुलित करना है और तुम चढ़ाना से पहले बस बर्तन से किसी भी तरल aspirateआर कोशिकाओं.
- ध्यान से hESC (या iPSC) तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक से शीशी को हटा दें.
- तेजी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कक्षों की जमी शीशी पिघलना, जब तक बस एक छोटी सी जमी हिस्सा शीशी में रहता है.
- शीशी स्प्रे के साथ 70% इसे शुद्ध करना और यह बाँझ ऊतक संस्कृति हुड हस्तांतरण isopropanol.
- Aseptically 15 एमएल शंक्वाकार 5 एमएल पिपेट का उपयोग ट्यूब में शीशी की संपूर्ण सामग्री के हस्तांतरण.
- KSR - एफएफ के 1 एमएल के साथ शीशी कुल्ला और 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब को जोड़ने.
- धीरे धीरे, KSR - एफएफ के 4 एमएल 15ml शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं के लिए ड्रॉप - बुद्धिमान जोड़ें. जबकि मध्यम जोड़ने, धीरे ट्यूब आगे और पीछे ले जाने के लिए कोशिकाओं का मिश्रण. (यह कोशिकाओं को आसमाटिक सदमे कम कर देता है).
- 15 एमएल 1000rpm (200 x छ) में कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सेल निलंबन के साथ ट्यूब अपकेंद्रित्र .
- ध्यान aspirate और सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- पूर्व गर्म KSR - एफएफ में सेल गोली (जैसे 4mL/60 मिमी पकवान) एक 5 एमएल पिपेट का उपयोग और धीरे कोशिकाओं विंदुक ऊपर और नीचे जब तक सेल गोली पूरी तरह से छितरी हुई है पुनः निलंबित. 70% से अधिक की व्यवहार्यता की उम्मीद है, लेकिन अगर व्यवहार्यता कम से कम 70% है, यह अब कोशिकाओं के लिए लेने के लिए संगम तक पहुँचने सकता है.
- वही विंदुक का प्रयोग, सेल निलंबन Geltrex लेपित संस्कृति पूर्व - equilibrated कमरे के तापमान पर पकवान करने के लिए ड्रॉप के लिहाज से हस्तांतरण.
- हवा में 4 से 6% सीओ 2 के एक humidified वातावरण के साथ, एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृति डिश रखें. ध्यान से पश्चिम पैटर्न को समान रूप से कोशिकाओं वितरित करने के लिए एक उत्तर दक्षिण, पूरब में ज़ुल्फ़ पोत.
- धीरे संस्कृति डिश तरल पदार्थ बदलने के 24 बजे के बाद पिघलना और उसके बाद दैनिक सेल मलबे को हटाने और ताजा पोषक तत्वों प्रदान जब तक पकवान लगभग 70-80% मिला हुआ है. जारी रखा और अपने आईपीएस कोशिकाओं की संस्कृति passaging के लिए, हमारे प्रोटोकॉल "फीडर मुक्त संस्कृति और मानव आईपीएस पूरा पीटा सीरम रिप्लेसमेंट का उपयोग प्रकोष्ठों के passaging फीडर मुफ्त मध्यम" शीर्षक देखें
अपेक्षित परिणाम
कोशिकाओं 70-80 मोटे तौर पर पहले cryopreservation के लिए मिला% होना चाहिए. ऊपर कर्लिंग और कॉलोनी हाशिये साथ कालोनियों की तह में पाचन परिणाम Dispase. कोशिकाओं कटाई के बाद वे cryopreservation मीडिया में छोटे clumps के रूप में जमे हुए हैं. एक बार शीशी thawed है, कोशिकाओं को ठीक करने के लिए और छोटे clumps के रूप में पूर्व लेपित पकवान देते हैं. वे तेजी से 5-6 दिनों में मिला हुआ डिश के लिए अग्रणी हो जाना.
तालिका 1 - अनुशंसित खंड
| घटक | 35 मिमी डिश | 60mm डिश | 100mm डिश |
| पूरा पीटा एसआर मध्यम | 2 एमएल | 4 एमएल | 10 एमएल |
| Geltrex समाधान | 1 एमएल | 1.5 एमएल | 4-5 एमएल |
| Dispase | 0.5 एमएल | 1 एमएल | 3-4 एमएल |
| Rinsing के लिए डी - पीबीएस | 2 एमएल | 4 एमएल | 10 एमएल |
कृपया परिशिष्ट को देख करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Disclosures
इस लेख के लेखक कि अभिकर्मकों और इस लेख में इस्तेमाल उपकरणों का उत्पादन जीवन टेक्नोलॉजीज द्वारा नियोजित कर रहे हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM/F12 | 12660-012 | Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061) | |
| KnockOut Serum Replacement | 10828-028 | ||
| KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail | A10580-01 | ||
| FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg | PHG0024 | Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes. | |
| 2-Mercapt–thanol | 21985-023 | ||
| Dispase | 17105-041 | Note: see appendix for alternative passaging methods | |
| Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL | A10480-01 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium | 14190-144 | ||
| DMSO, 500mL | JT Baker | JT9224-1 | |
| Sterile Tissue Culture Hood | |||
| Incubator set at 37°C | |||
| Pipette-Aid | |||
| Water Bath set at 37°C | |||
| Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL) | |||
| Centrifuge | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 60 mm Tissue Culture treated dishes | |||
| Liquid nitrogen storage tank | |||
| Isopropanol freezing containers | |||
| 1.5 mL Cryovials |
References
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- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
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