Summary
Этот протокол описывает подробную процедуру cryopreserving плюрипотентных клеток человека в нокаут среду криоконсервации SR и восстановления этих клеток в полной KnockOut SR подачи Free (КСР-FF), средний или подачи основе KnockOut SR среды.
Abstract
Открытие в 2006 году, что человеческие и мышиных фибробластов может быть перепрограммирован для получения плюрипотентных клетках 1-3 с качествами, удивительно похожи на эмбриональные стволовые клетки создал новую ценную источником плюрипотентных клеток для открытия новых лекарств, клеточная терапия, и фундаментальных исследований.
GIBCO СМИ и реагенты были на переднем крае плюрипотентных исследований стволовых клеток в течение многих лет. Нокаут DMEM дополнен Нокаут сыворотки Замена средств по выбору для эмбрионального роста стволовых клеток, а теперь плюрипотентных клеточных культур 3-9. Это золотой стандарт системы средств массовой информации теперь может быть использован для подачи без культуры с добавлением Knockout SR Коктейль фактор роста.
Традиционные человека плюрипотентных ES и методов клеточной культуры требует использования мыши или человека слоев фибробластов подачи или подачи с кондиционером среды. Эти культуры методы трудоемки, трудно масштабировать и трудно поддерживать бедра клетки недифференцированной из-за неопределенных условиях. Invitrogen разработала Нокаут SR фактор роста коктейль, чтобы позволить Вам легко перейти ваши бедра и культур ЭСК ячейки подачи без сохраняя при этом ваше использование Нокаут SR.
Protocol
Примечание: Для поддержания стерильных условиях культуры, все процедуры в данном протоколе проводятся с использованием стерильной лабораторной практики и проводится в соответствии ламинарном боксе.
Перед началом, убедитесь, что любые средства массовой информации находится в равновесии до 37 ° С и надлежащим образом в газовых камерах.
Подготовка Geltrex покрытием Блюда культуры
Примечание: см. приложение для использования CELLstart покрытием блюда культуры.
- Оттепель одна трубка Geltrex (1 мл) медленно при температуре 2-8 ° С и разбавленных 1:100 она в 99 мл Нокаут D-MEM/F-12. Смешайте раствор нежно.
Примечание: Некоторые линий плюрипотентных клеток могут требовать различные разведения Geltrex для оптимального роста. См. приложение для альтернативного разведения. - Обложка всей поверхности каждой культуры блюдо с решением Geltrex (1 мл на 35-мм блюдо, 1,5 мл для 60-мм блюдо).
- Печать каждое блюдо с парафильмом для предотвращения высыхания и инкубировать блюда в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
Примечание: На данном этапе вы можете хранить Geltrex покрытием блюда культуры при 4 ° С в течение 1 месяца. Печать каждое блюдо с парафильмом для предотвращения Geltrex от высыхания. - Перед началом использования, передачи Geltrex покрытием блюда ламинарном боксе и позволит им, чтобы уравновесить до комнатной температуры (около 1 часа).
Подготовка Полное питатель-Free SR KnockOut среднего
- Для приготовления 1 мл 10 мкг / мл Базовое решение FGF, асептически смесь компонентов, перечисленных ниже. Алиготе решение и хранить при температуре -20 ° С до 6 месяцев.
Основные FGF 10 мкг D-PBS 990μL 10% BSA 10 мкл
Примечание: BSA может быть заменен или HSA Нокаут SR на той же концентрации. - Для подготовки 50 мл 2 мг / мл Dispase решение, асептически смесь компонентов, перечисленных ниже. Фильтры стерилизации раствора и хранить при 4 ° С в течение 2 недель.
Dispase 100 мг D-PBS 50 мл - Для подготовки 100 мл полной SR KnockOut питатель-Free (КСР-FF) асептически объединить компоненты, перечисленные в таблице ниже.
Компонент Концентрация сток Конечная концентрация Объем Нокаут DMEM/F12 (кат. нет. 12660-012) - 1X 76,8 мл GlutaMAX-I (кат. № 35050-061) 200 мМ 2 мМ 1 мл KnockOut SR (кат. нет. 10828-028) - 20% 20 мл KnockOut SR-GFC (кат. нет. A10580-01) 50X 1X 2 мл bFGF (кат. нет. PHG0024). 10 мкг / мл 20 нг / мл 200 мкл
Вы можете хранить KSR-FF среде при температуре 2-8 ° С не более одной недели. - Перед предварительно уравновешивающая полной среде с температурой и газами, асептически добавить необходимый объем 2 меркаптоэтанол (55 мМ фондовом концентрация) для 0,1 ммоль конечной концентрации. Например, чтобы подготовить 100 мл KSR-FF средний добавить 182 мкл 55 мМ 2-меркаптоэтанол (1:550 разведение) Кроме того, 2-меркаптоэтанол могут быть добавлены к 1X завершены средние и хранить при температуре 2-8 ° С не более одной недели.
Подготовка Замораживание / Криоконсервация среднего
Криоконсервация среда состоит из двух средств массовой информации; Замораживание среднего и морозильные Б. Средний Они будут добавлены к клеткам в разное время и должны оставаться разделены. Каждый из них 50% от общего объема Криоконсервация Средний необходимости. Общий объем Криоконсервация Средний необходимо, так это 1 мл для каждого флакона должны быть заморожены. 90% сливной 60мм блюдо чЭСК могут быть использованы для банка 2 флаконов чЭСК в криоконсервации СМИ.
Подготовка достаточного объема каждого Замораживание среды с дополнительными 2-5 мл для обеспечения превышения.
| Замораживание среднего (50% от конечного объема): | 50% DMEM/F12 | 50% КСР |
| Замораживание среднего B (50% от конечного объема): | 80% DMEM/F12 | 20% ДМСО |
Пример:
Если вы замораживания 20 флаконов клетки, вам необходимо 20 мл Криоконсервация Средний. Добавить 4 мл за превышения в общей сложности 24mL Средний Криоконсервация. Это означает, что вам нужно 12 мл замораживания среднего (50% 24mL) и 12 мл замораживания B среднего (50% 24mL).
| Замораживание среднего (12 мл): | 6 мл DMEM/F12 | 6 мл KSR |
| Замораживание среднего B (12 мл): | 9,6 мл DMEM/F12 | 2,4 мл ДМСО |
Окончательный состав Криоконсервация среднего составляет 65% DMEM/F12, 25% КСР, а 10% ДМСО.
Cryopreserving iPSCs
- Предварительно теплой необходимый объем Dispase в 37 ° С водяной бане. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется.
- Предварительно равновесие необходимый объем KSR-FF в 37 ° С водяной бане for15 мин. Обратитесь к таблице 1below подробнее об объемах требуется.
- Аспирируйте провел среды из сосуда для культивирования с помощью пипетки, и промойте клетки дважды с D-PBS.
- Аккуратно добавить подогретого Dispase решение культуры судна (например, 1 мл раствора на Dispase 60-мм культуры блюдо). Swirl культуры судна, чтобы покрыть всю поверхность клетки.
- Инкубируйте культуру судна при температуре 37 ° С в течение 3 минут.
- Удалить сосуд из инкубатора, аспирация Dispase решение, и осторожно мыть клетки с D-PBS.
- Аккуратно очистить клетки с поверхности культуры блюдо, используя сотовый скребок и передачи клеткам стерильные 15 мл центрифужную пробирку.
- Промыть культуры блюдо дважды с KSR-FF, мягко "распыления от" любой клетки, которые не отделены. Бассейн промыть среды с клетками в 15 мл трубки.
- Центрифуга трубке при 200 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре до гранул клеток.
- Тщательно аспирата супернатант, не нарушая осадок клеток и отбросить его.
- Подготовить достаточное количество криопробирки. Как только клетки находятся в контакте с ДМСО, они должны быть аликвоты и замороженные в течение 2-3 минут.
- Аккуратно вылить содержимое трубки, чтобы полностью вытеснить клеточный осадок из трубки дно и вновь приостановить клеток в Замораживание А. среды [, осторожно пипетирования вверх и вниз с помощью 5-мл серологические пипетки]. После однородной суспензии сгустков, добавляют равный объем Замораживание В средней до этого, в капле мудрым образом, мягко закрученного клеточную суспензию перемешать.
Примечание: На данном этапе клетки находятся в контакте с ДМСО, и работа должна быть выполнена эффективно. Как только клетки находятся в контакте с ДМСО, они должны быть аликвоты и замороженные в течение 2-3 минут. - Алиготе 1 мл клеточной суспензии в каждый криопробирку.
- Быстро место флаконов в морозный г-н [быстро заморозить] и перенести его на -80 ° С в течение ночи.
- После ночи хранения при температуре -80 ° С, передача клетки резервуар жидкого азота для длительного хранения.
IPSC оттепели флакон и восстановления клеток
Примечание: KSR-FF может быть заменен KSR-содержащих MEF-кондиционированной среды, или KSR средой для использования с фидеров. См. приложение к инструкции по подготовке средств массовой информации.
Предварительно 10 мл теплой KSR-FF среды в 50 мл трубки.
- Уравновесить соответствующим количеством Geltrex покрытием блюд до комнатной температуры и аспирации жидкости из любого блюда непосредственно перед покрытием выГ клеток.
- Осторожно снимите чЭСК (или IPSC) флакон с жидкой резервуар для хранения азота.
- Быстро размораживайте флакон клеток в 37 ° С водяной бане, пока только небольшой кусок замороженного остается во флаконе.
- Спрей флакон с 70% изопропанола для обеззараживания его и перенести его на стерильную капот культуры ткани.
- Асептических условиях передачи все содержимое флакона в 15 мл коническую трубку с помощью 5 мл пипетки.
- Промойте флакон с 1 мл KSR-FF и добавьте к 15 мл центрифужную пробирку.
- Медленно, добавить 4 мл KSR-FF каплям к ячейкам в 15 мл коническую трубку. При добавлении среде, мягко перемещать зонд вперед и назад, чтобы смесь клеток. (Это уменьшает осмотический шок для клеток).
- Центрифуга 15 мл трубки с клеточной суспензии при 1000rpm (200 х г) в течение 2 минут при комнатной температуре.
- Тщательно аспирации и отбросить супернатант, не нарушая клеточный осадок.
- Повторное приостановить осадок клеток в подогретого KSR-FF (например 4mL/60 мм блюдо) с помощью 5 мл пипетки и осторожно пипеткой клетки вверх и вниз, пока осадок клеток полностью рассеялись. Жизнеспособность более 70%, как ожидается, поэтому если жизнеспособность составляет менее 70%, это может занять больше времени для клеток достичь слияния.
- Используя ту же пипетку, передачи клеточной суспензии по каплям к Geltrex покрытием культуры блюдо предварительно доведены до комнатной температуры.
- Место культуры блюдо в 37 ° С инкубатор, с влажной атмосфере от 4 до 6% СО 2 в воздухе. Тщательно водоворот судна в направлении с севера на юг, с востока на запад шаблон, чтобы равномерно распределить клетки.
- Аккуратно жидкостью изменить культуру блюдо 24 часа после оттепели и ежедневно после этого удалить ячейки мусором, а также предоставить свежие питательные вещества, пока блюдо составляет примерно 70-80% вырожденная. Для сохранения культуры и пассажи ваш плюрипотентных клеток, обратитесь к нашему протокол под названием "питатель-Free культуры и пассажи плюрипотентных клеток человека использовании Полное KnockOut сыворотки Замена подачи среды без"
Ожидаемые результаты
Клетки должна быть примерно 70-80% сливной до криоконсервации. Dispase пищеварения результатов в керлинг и складывания колоний вдоль колонии полей. После сбора урожая клетки они заморожены как маленькие сгустки в криоконсервации СМИ. Как только флакон оттаяли, восстановить клетки и приложить к предварительно покрытых блюдо как небольшие пряди. Они растут быстро, ведущие к сливной блюдо в 5-6 дней.
Таблица 1 - Рекомендуемые объемы
| Компонент | 35 блюд | Блюдо 60 мм | Блюдо 100 мм |
| Полное KnockOut SR среда | 2 мл | 4 мл | 10 мл |
| Решение Geltrex | 1 мл | 1,5 мл | 4-5 мл |
| Dispase | 0,5 мл | 1 мл | 3-4 мл |
| D-PBS для полоскания | 2 мл | 4 мл | 10 мл |
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть приложение .
Disclosures
Авторы этой статьи являются сотрудниками Life Technologies, которая производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM/F12 | 12660-012 | Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061) | |
| KnockOut Serum Replacement | 10828-028 | ||
| KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail | A10580-01 | ||
| FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg | PHG0024 | Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes. | |
| 2-Mercapt–thanol | 21985-023 | ||
| Dispase | 17105-041 | Note: see appendix for alternative passaging methods | |
| Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL | A10480-01 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium | 14190-144 | ||
| DMSO, 500mL | JT Baker | JT9224-1 | |
| Sterile Tissue Culture Hood | |||
| Incubator set at 37°C | |||
| Pipette-Aid | |||
| Water Bath set at 37°C | |||
| Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL) | |||
| Centrifuge | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 60 mm Tissue Culture treated dishes | |||
| Liquid nitrogen storage tank | |||
| Isopropanol freezing containers | |||
| 1.5 mL Cryovials |
References
- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Maherali, N. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
- Li, W. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
- Liao, J. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).
- Dimos, J. T. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
- Aasen, T. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).
- Park, I. H. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).
