Summary
CFSE étiquettes de façon covalente à long terme avec les molécules intracellulaires colorant fluorescent, carboxyfluorescéine. En tant que tel, quand une cellule se divise CFSE-étiquetés, sa descendance ont la moitié de la quantité de fluorescence, qui peut ainsi être utilisée pour évaluer la division cellulaire. Cet article décrit les procédures généralement utilisées pour le marquage des lymphocytes de souris avec CFSE.
Abstract
Carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) est un moyen efficace et populaire pour surveiller la division des lymphocytes 1-3. CFSE étiquettes de façon covalente à long terme avec les molécules intracellulaires colorant fluorescent, carboxyfluorescéine. Ainsi, quand une cellule se divise CFSE-étiquetés, sa descendance sont doués de moitié le nombre de carboxyfluorescéine molécules étiquetées et donc à chaque division cellulaire peut être évaluée en mesurant la diminution correspondante de la fluorescence des cellules par cytométrie en flux. La capacité de CFSE pour étiqueter des populations de lymphocytes avec une haute intensité de fluorescence de la variance exceptionnellement faible, couplé à sa toxicité cellulaire faible, en font un colorant idéal pour mesurer la division cellulaire. Comme il est un colorant à la fluorescéine base, il est également compatible avec une large gamme d'autres fluorochromes rendant applicable à la cytométrie de flux multi-couleurs. Cet article décrit les procédures généralement utilisées pour le marquage des lymphocytes de souris dans le but de surveiller jusqu'à 8 divisions cellulaires. Ces cellules marquées peuvent être utilisées à la fois in vitro et in vivo.
Protocol
Configuration Réactif 1)
1.1) solution stock CFSE
Le colorant CFSE est acheté comme carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFDA, SE) (MW 557.47 g / mol), généralement dans flacons de 25 mg. Dissoudre le 25 mg de 8,96 ml de DMSO pour une solution stock de finale de 5 mM (magasin que 50-100 aliquotes à -20 ° C pendant plusieurs mois). CFDA, SE va réagir avec une solution aqueuse il est donc essentiel que cette exposition soit évitée lors du stockage.
1.2) Lymphocytes
Isoler les lymphocytes de la rate et des ganglions lymphatiques de souris et de remettre en suspension dans 1 ml de milieu de culture (par exemple RPMI) avec 5% inactivé à la chaleur (HI) sérum de veau foetal (FCS), avec une concentration cellulaire de 0,5 x 6 au 10 oct x 10 7 / mL.
Étiquetage CFSE 2)
2.1 Méthode de routine):
- Bien resuspendre les cellules dans le volume 1 ml de milieu et la place soigneusement dans le fond d'une fraîche (non mouillées) tube conique de 10 ml.
- Posez le tube horizontalement (à l'aide d'un tube non mouillé empêchera l'1 ml de suspension de cellules de se déplacer et prématurément le mélange avec le CFDA, SE solutions).
- Ajouter avec précaution 110 ul de PBS pour la partie non mouillée de la matière plastique au sommet du tube de s'assurer qu'il ne fait pas de contact avec la solution cellulaire.
- Resuspendre 1,1 uL du stock de 5 mM de CFDA, SE dans le PBS 110 pi.
- Vite hermétiquement le tube et inverser et le vortex ainsi d'obtenir rapidement uniformes mélange des solutions. Notez que le colorant est CFSE à une concentration finale de 5 uM, cependant, la concentration optimale peut être déterminée pour chaque lot préparé, puis vérifié tous les 6 mois pour s'assurer qu'il est efficace.
- Incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante. Notez que lors de la conversion du CFDA, SE CFSE (voir la discussion) le colorant devient fluorescent et donc sujettes à la décoloration par l'exposition à une lumière excessive. Ainsi, il est conseillé de protéger le tube de la lumière à partir de ce moment, par exemple en le couvrant avec du papier aluminium.
- Laver les cellules en diluant dans 10 volumes de 20 ° C PBS contenant 5% de FCS HI, sédimentation par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 20 ° C et jeter le surnageant. Répétez laver deux fois plus.
2.2 Méthode alternative), qui est également approprié pour le nombre de cellules plus élevée (10 - 30 x 10 7):
- Préparer un 2 x (10 uM) CFDA, la solution de SE en ajoutant 2 ul du stock 5 mm à 1 mL de PBS et rapidement ajouter à 1 ml de cellules soigneusement remis en suspension, puis rapidement hermétiquement le tube et inverser et le vortex ainsi d'obtenir uniformes rapidement le mélange.
- Incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante et laver comme dans les étapes 2.1 (f) et 2.1 (g).
2.3) Les cellules peuvent ensuite être appliqués à un protocole d'intérêt pour l'induction de la division cellulaire. Les cellules marquées peuvent être utilisées dans les deux in vitro et in vivo.
2.4) À la fin de l'essai de prolifération, les cellules sont récoltées et analysées par cytométrie en flux (voir ci-dessous pour des exemples représentatifs).
Résultats Représentant 3)
Afin d'évaluer la prolifération des lymphocytes par dilution CFSE, il est utile de connaître la fluorescence des cellules indivise (soit un maximum de fluorescence) et non-étiquetées cellules (fluorescence soit un minimum). Par conséquent, votre design expérimental devrait prendre en compte ces contrôles. Voici des exemples d'études in vitro et in vivo utilisant CFSE pour mesurer CD8 + T division cellulaire par cytométrie en flux.
3.1) La stimulation in vitro
La figure 1 montre les profils de CFSE CFSE marqué l'ovalbumine (OVA) T spécifiques des récepteurs des cellules transgéniques CD8 + T OT-je cellules après 3 jours de culture avec des cellules dendritiques pulsées avec différentes quantités d'OVA. Lymphocytes T CD8 + purifiées à partir des ganglions lymphatiques de la rate et le OT-je souris ont été marquées avec CFSE et 1 x 10 5 cellules en culture avec 3,3 x 10 4 DC. DC, où pulsées à l'OVA pendant 1 heure à 37 ° C et lavées deux fois avant de la culture. Après 3 jours, les cellules ont été récoltés et étiquetés avec des anti-CD8-APC anticorps et Hoechst 33258, puis analysées par cytométrie en flux (50 000 événements collectés). Live (Hoechst 33258 -) CD8 + sont présentés. Comme contrôles, les cellules CD8 + T cultivés seuls, montre l'intensité de la non-CFSE divisée cellules, tandis que les cellules non marquées montre l'auto-fluorescence des cellules et les limites de divisions cellulaires détectables. Notez que quatre sommets CFSE peut être vu dans chacun des panneaux, dans cet exemple, ce qui indique que les cellules ont subi jusqu'à 3 divisions.
3.2) stimulation in vivo
La figure 2 montre les profils de CFSE CFSE marqués spécifiques de l'OVA récepteur des cellules T CD8 + transgéniques OT-I des cellules T après 3 jours in vivo in présence de 20 mg d'OVA. Lymphocytes T CD8 + purifiées à partir des ganglions lymphatiques de la rate et CD45.1 congéniques OT-je souris ont été marquées avec CFSE et 5 x 10 6 cellules injectées iv dans la veine latérale de la queue du C56BL/6J (CD45.2 +) les souris. Après les souris ont été injectés 2 h iv avec 20 ug d'OVA. Après 3 jours, les rates des souris ont été recueillies, faite dans une suspension cellulaire unique, étiqueté avec des anti-B220-PerCP, anti-CD8-APC-Cy7 et anti-CD45.1-PE-Cy7 anticorps et Hoechst 33258 et ensuite analysées par cytométrie en flux (1.000.000 événements collectés). Live (Hoechst 33258 -) B220-cellules sont affichés dans le panneau de gauche et fermée CD8 + CD45.1 + cellules montré dans le panneau de droite. Comme contrôles, non stimulées CFSE marqué cellules T CD8 +, montre l'intensité de la non-CFSE divisée cellules, tandis que les non-étiquetées cellules montre l'auto-fluorescence des cellules et les limites de divisions cellulaires détectables. Notez que l'utilisation de la différence CD45 allotypiques est essentiel pour résoudre les CD8 + transférées cellules T de l'hôte, car ils sont un sous-ensemble mineur de la totalité des cellules CD8 T + (panneau de gauche). Notez que la plupart des cellules tombent dans les 7 sommets CFSE dans cet exemple (à droite), indiquant que les cellules ont subi jusqu'à 6 divisions.
Figure 1. Possibilité de CFSE marqué l'ovalbumine (OVA) T spécifiques des récepteurs des cellules transgéniques CD8 + OT-I des cellules T à réagir in vitro à la DC pulsée avec différentes concentrations de l'OVA, les données présentées sont après 3 jours de culture. Remarque non divisée population de T CD8 + cellules en l'absence d'antigène (lumière histogramme gris) et l'auto-fluorescence de la population non-étiquetées (histogramme gris foncé). La figure illustre cellules T CD8 + qui ont divisé 1-3 fois basée sur des pics de dilution CFSE, avec plus de cellules T à la division concentrations d'antigène plus élevée.
Figure 2. Possibilité de CFSE marqué l'ovalbumine (OVA) T spécifiques des récepteurs des cellules transgéniques CD8 + OT-I des cellules T, quand adoptive transférées dans des souris C57BL / 6 pour répondre à l'OVA, les données présentées 3 jours après le transfert adoptif de gauche:. CD8 +, CD45. 1 + cellules T OT-1 dans les souris receveuses. Panneau de droite: profil de prolifération CFSE. Remarque non divisée population de cellules T CD8 + dans les souris receveuses ne recevant pas d'antigène (lumière histogramme gris) et l'auto-fluorescence des lymphocytes non-étiquetées (histogramme gris foncé). La figure illustre les cellules CD8 + T qui ont divisé 1-6 fois basée sur des pics de dilution CFSE.
Figure 3. Une représentation des différents événements moléculaires qui se produisent pendant le marquage des cellules avec des carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFDA, SE). Pour plus de détails sur le processus de voir le texte de discussion. Note: «CFSE« Le sigle générique, et non CFDA, SE, est utilisé pour décrire le réactif de marquage et de la procédure de labellisation en général. Chiffre basé sur Paroisse 4.
Discussion
Afin de comprendre comment fonctionne et pourquoi CFSE étiquetage uniforme rapide est nécessaire pour son utilisation dans l'analyse de la prolifération, il est utile de comprendre les bases moléculaires de marquage des cellules CFSE. Ceci peut être divisé en deux phases, 1) entrée dans la cellule et l'étiquetage des protéines 2) (figure 3). 1) entrée dans la cellule: entrée du colorant dans la cellule est médiée par la forme diacétylés de la teinture, le diacétate de carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFDA, SE). Les acétates rendre la membrane perméants colorant fortement en permettant à ses flux rapide à travers la membrane plasmique. Estérases, présentes dans la cellule, cliver les acétates du CFDA, SE et ainsi donner naissance à la forme CFSE du colorant qui est beaucoup moins pénétrants membrane, concentrant ainsi le colorant dans la cellule. Marquage des protéines 2): Alors que les deux CFDA, SE et CFSE ont aminés des chaînes latérales réactives succinimidyle, seul le CFSE est fluorescent. La forte concentration intracellulaire de CFSE facilite l'étiquetage rapide et de haute niveau intracellulaire des protéines. L'étiquetage des cellules CFSE doit être effectuée rapidement afin d'obtenir une population homogène de cellules étiquetées, ce qui est essentiel pour résoudre les cellules qui ont subi plusieurs divisions, comme indiqué dans les résultats représentatifs (figure 1 et 2).
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le travail présenté dans cet article a été soutenu par une Santé nationale et du Medical Research Council (NHMRC) de l'Australie du Programme de subventions (CRP) et une subvention de projet NHMRC (CRP et BJCQ). Aussi BJCQ est un NHMRC Peter Doherty boursier postdoctoral.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFDA,SE | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| DMSO | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lymphocytes | eg mouse or human | ||
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | ||
| FCS | SAFC Global | ||
| 10-15ml conical tubes | Falcon BD | ||
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Aluminium foil | Capral Aluminium | ||
| Vortex | Scientific Industries Inc. | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer | BD Biosciences |
References
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2009).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
