Summary
CFSE etiketter kovalent långlivade intracellulära molekyler med fluorescerande färg, carboxyfluorescein. Som sådan, när en CFSE-märkt cell delar sig, dess avkomma har hälften av fluorescens, som därmed kan användas för att bedöma celldelning. Den här artikeln beskriver de förfaranden som normalt används för märkning mus lymfocyter med CFSE.
Abstract
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) är ett effektivt och populärt sätt att övervaka lymfocyter division 1-3. CFSE etiketter kovalent långlivade intracellulära molekyler med fluorescerande färg, carboxyfluorescein. Så när en CFSE-märkt cell delar sig, är dess avkomma utrustade med hälften av antalet carboxyfluorescein taggade-molekyler och därmed varje celldelning kan bedömas genom att mäta motsvarande minskning i cell fluorescens via flödescytometri. Kapaciteten i CFSE att märka lymfocytpopulationer med hög fluorescerande intensitet exceptionellt låg varians i kombination med dess låga celltoxicitet, gör den till en idealisk färgämne för att mäta celldelning. Eftersom det är en fluorescein-baserad färg det är också kompatibel med ett brett utbud av andra fluorokromer gör det som gäller för flera färger flödescytometri. Den här artikeln beskriver de förfaranden som normalt används för märkning mus lymfocyter för att övervaka upp till 8 celldelningar. Dessa är märkta celler kan användas för både in vitro och in vivo-studier.
Protocol
1) Reagens Setup
1,1) CFSE stamlösning
Den CFSE färgämne köps som carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFDA, SE) (MW 557,47 g / mol), vanligtvis i 25 mg injektionsflaskor. Lös upp 25 mg i 8,96 ml DMSO för en slutgiltig stamlösning av 5 mm (lagra 50-100 mikroliter alikvoter vid -20 ° C i flera månader). CFDA, SE kommer att reagera med vattenlösning så det är viktigt att sådan exponering undviks under lagring.
1,2) Lymfocyter
Isolera lymfocyter från mjälten och eller lymfkörtlar från möss och återsuspendera i 1 ml odlingsmedium (t.ex. RPMI) med 5% värmeinaktiveras (HI) fetalt kalvserum (FCS), med en cell koncentration mellan 0,5 x 06 till 10 oktober x 10 7 / ml.
2) CFSE Labeling
2,1) rutinmetod:
- Grundligt resuspendera cellerna i 1 mL av medium och lägg försiktigt i botten av en ny (icke-fuktade) 10 ml koniska rör.
- Lägg röret horisontellt (med hjälp av en icke-fuktade röret förhindrar att 1 ml-cellsuspension från att flytta och för tidigt blandas med CFDA, SE-lösningar).
- Tillsätt försiktigt 110 mikroliter PBS till den icke-fuktade delen av plasten på toppen av röret säkerställa att den inte får kontakt med cellen lösningen.
- Resuspendera 1,1 mikroliter av 5 mM lager av CFDA, SE i 110 mikroliter PBS.
- Snabbt locket på röret och vänd och skaka väl för att få snabb enhetlig blandning av lösningarna. Observera att CFSE färgen på en slutlig koncentration av 5 mikroM kan dock den optimala koncentrationen måste fastställas för varje förberedda parti, och sedan kontrolleras var 6 månader för att säkerställa att den är effektiv.
- Inkubera cellerna i 5 min vid rumstemperatur. Notera att vid konvertering av CFDA, SE att CFSE (se diskussion) färgen blir fluorescerande och därmed utsatt för blekning av exponering för starkt ljus. Därför är det lämpligt att skydda röret från ljuset från denna punkt på, till exempel genom att täcka den med aluminiumfolie.
- Tvätta cellerna genom att späda i 10 volymer av 20 ° C PBS innehållande 5% HI FCS, sedimenterande genom centrifugering vid 300 xgi 5 minuter vid 20 ° C och kasta supernatanten. Upprepa tvätta ytterligare två gånger.
2,2) Alternativ metod, som också är lämplig för högre cell nummer (10 - 30 x 10 7):
- Förbered en 2 x (10 M) CFDA, SE-lösning genom att tillsätta 2 mikroliter av 5 mM lager till 1 mL PBS och snabbt lägga till denna till 1 ml grundligt återsuspenderade celler, sedan snabbt locket på röret och vänd och skaka väl för att få snabb enhetlig blandning.
- Inkubera cellerna i 5 minuter i rumstemperatur och tvätta som i steg 2.1 (f) och 2,1 (g).
2,3) Celler kan sedan appliceras på ett protokoll av intresse för framkallande av celldelning. Märkta celler kan användas både in vitro och in vivo.
2,4) Efter fullföljande av spridningen analys, celler skördas och analyseras med flödescytometri (se nedan för representativa exempel).
3) representativa resultat
För att bedöma lymfocyter spridning av CFSE utspädning, är det bra att känna till fluorescens odelade celler (dvs. maximal fluorescens) och icke-märkta celler (dvs minsta fluorescens). Därför bör din experimentell design ta dessa kontroller i beaktande. Nedan är exempel på in vitro och in vivo med hjälp av CFSE att mäta CD8 + T-celldelning med flödescytometri.
3,1) In vitro stimulering
Figur 1 visar CFSE profiler CFSE-märkta äggalbumin (OVA)-specifika T cells receptor transgena CD8 + OT-I T-celler efter 3 dagar kultur med dendritiska celler pulsade med olika mängder av ägg. CD8 + T-celler renas från mjälte och lymfknutor OT-Jag möss märkt med CFSE och 1 x 10 5 celler odlade med 3,3 x 10 4 DC. DC där pulsade med OVA för 1 timme vid 37 ° C och tvättas två gånger innan kulturen. Efter 3 dagar, celler där skördas och märkt med anti-CD8-APC antikroppar och Hoechst 33.258 och därefter analyseras med flödescytometri (50.000 händelser samlas in). Live (Hoechst 33.258 -) är CD8 + celler visas. Som kontroller, CD8 + T-celler odlade ensam, visar CFSE intensiteten av icke indelas-celler, medan de icke-märkta celler visar automatiskt fluorescens av cellerna och begränsningarna av detekterbara celldelningar. Observera att 4 CFSE toppar kan ses i varje av de paneler som i detta exempel, vilket tyder på att cellerna har genomgått upp till 3 divisioner.
3,2) In vivo-stimulering
Figur 2 visar CFSE profiler CFSE märkt OVA-specifika T cells receptor transgena CD8 + OT-I T-celler efter 3 dagar in vivo in närvaro av 20 mikrogram OVA. CD8 + T-celler renas från mjälte och lymfknutor CD45.1 congenic OT-Jag möss märkt med CFSE och 5 x 10 6 celler injiceras iv i laterala svansvenen av C56BL/6J (CD45.2 +) möss. Efter 2 tim möss injicerades IV med 20 mikrogram OVA. Efter tre dagar var mjälte från mössen in, görs till en enda cell fjädring, märkt med anti-B220-PerCP, anti-CD8-APC-Cy7 och anti-CD45.1-PE-Cy7 antikroppar och Hoechst 33.258 och sedan analyseras med flödescytometri (1.000.000 händelser samlas in). Live (Hoechst 33.258 -) B220-celler visas i vänstra panelen och gated CD8 + CD45.1 + celler som visas i högra panelen. Som kontroller, ostimulerade CFSE-märkt CD8 + T-celler, visar CFSE intensiteten av icke indelas-celler, medan de icke-märkta celler visar automatiskt fluorescens av cellerna och begränsningarna av detekterbara celldelningar. Observera att användningen av CD45 allotypic skillnaden är avgörande för att lösa de överförda CD8 + T celler från värd, eftersom de är en mindre delmängd av den totala CD8 + T-celler (till vänster). Observera att de flesta cellerna faller inom 7 CFSE toppar i detta exempel (högra panelen), vilket indikerar att cellerna har genomgått upp till 6 divisioner.
Figur 1. Förmåga CFSE märkt äggalbumin (OVA)-specifika T cells receptor transgena CD8 + OT-I T-celler att svara in vitro till DC pulsade med olika koncentrationer av ägg, data visat att efter 3 dagar kulturen. Observera icke uppdelad population av CD8 + T celler i frånvaro av antigen (ljusgrå histogram) och auto-fluorescens av icke-märkta befolkningen (mörkgrå histogram). I Figur visar CD8 + T-celler som har delat 1-3 gånger baserat på CFSE utspädning toppar, med fler T-celler att dela på de högre antigen koncentrationer.
Figur 2. Förmåga CFSE-märkta äggalbumin (OVA)-specifika T cells receptor transgena CD8 + OT-I T-celler, när adoptively över till C57BL / 6 möss att svara på OVA, data som visas 3 dagar efter adoptiv transfer Vänster panel:. CD8 +, CD45. 1 + OT-1 T-celler i mottagarens möss. Högra panelen: CFSE spridning profil. Notera icke uppdelad population av CD8 + T-celler i mottagarens möss som inte fick antigen (ljusgrå histogram) och auto-fluorescens av icke-märkta lymfocyter (mörkgrå histogram). I Figur visar CD8 + T-celler som har delat 1-6 gånger baserat på CFSE utspädning toppar.
Figur 3. En representation av olika molekylära händelser som inträffar under märkning av celler med carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFDA, SE). För detaljer om processen se diskussion text. Obs: Den generiska förkortningen "CFSE", inte CFDA, SE, används för att beskriva märkning reagens och märkning förfarandet i allmänhet. Siffran bygger på Parish 4.
Discussion
För att uppskatta hur CFSE fungerar och varför snabba enhetlig märkning krävs för dess användning i spridning analys är det bra att förstå den molekylära grunden för CFSE cell märkning. Denna kan delas in i två faser, 1) Cell inresa och 2) Protein märkning (Figur 3). 1) Cell post: Inmatning av färgen in i cellen medieras av det diacetylerade form av färg, carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFDA, SE). Den acetater gör färgen mycket membranet permeant låta dess snabba flux över plasmamembranet. Esteraser, vistas i cellen, klyva acetater från CFDA, SE och därmed ge upphov till CFSE form av färg som är mycket mindre membran permeant, med fokus på så sätt färgen i cellen. 2) Protein märkning: Medan både CFDA, SE och CFSE har amino-reaktiva succinimidyl sidokedjor är det bara CFSE fluorescerande. Den höga intracellulära koncentrationen av CFSE underlättar snabba och höga intracellulära märkning av proteiner. CFSE märkning av celler måste ske snabbt för att få ett homogent märkt population av celler, vilket är avgörande för att lösa celler som har genomgått flera divisioner som visas i representativa resultat (Figur 1 och 2).
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbetet som redovisas i denna artikel stöddes av ett nationellt hälso-och medicinska forskningsrådet (NHMRC) i Australien Program Grant (CRP) och en NHMRC Project Grant (CRP och BJCQ). Även BJCQ är en NHMRC Peter Doherty forskarassistent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFDA,SE | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| DMSO | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lymphocytes | eg mouse or human | ||
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | ||
| FCS | SAFC Global | ||
| 10-15ml conical tubes | Falcon BD | ||
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Aluminium foil | Capral Aluminium | ||
| Vortex | Scientific Industries Inc. | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer | BD Biosciences |
References
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2009).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
