שיטות מניפולציות ניסויית, לאחר חיתוך רוחב עצב הראייה של מערכת העצבים המרכזית היונקים

Summary

חיתוך רוחב עצב הראייה הוא מודל בשימוש נרחב של פגיעה במערכת העצבים המרכזית מבוגר. מודל זה הוא אידיאלי עבור ביצוע מספר מניפולציות ניסיוני כי היעד של הרשתית גלובלי או ישירות ליעד אוכלוסייה של תאים עצביים נפצעו הגנגליון ברשתית.

Abstract

בתאי גנגליון רשתית (RGCs) הם נוירונים במערכת העצבים המרכזית, כי פלט מידע חזותי מהרשתית אל המוח, באמצעות עצב הראייה. העצב האופטי ניתן לגשת בתוך מסלולו של העין transected לחלוטין (axotomized), חיתוך האקסונים של האוכלוסייה RGC כולו. חיתוך רוחב עצב הראייה הוא מודל לשחזור של מוות תאים אפופטוטיים נוירונים ב CNS הבוגרת ^1-4. מודל זה הינו אטרקטיבי במיוחד מאחר קאמרית הזגוגית של העין פועלת כמו כמוסה עבור משלוח הסמים אל הרשתית, המתיר מניפולציות ניסיוני באמצעות זריקות התוך עיני. דיפוזיה של חומרים דרך הנוזל הזגוגי מבטיחה כי הם פועלים על האוכלוסייה RGC כולו. וקטורים ויראליים, פלסמידים או RNAs התערבות קצר (siRNAs) יכול גם להיות מועברת לתא זגוגי על מנת להדביק תאים ברשתית או transfect ^5-12. כמיהות גבוהה של Adeno-Associated Virus (AAV) וקטורים מועילה RGCs היעד, עם שיעור זיהום מתקרב 90% של תאים ליד הזריקה ^{6, 7, 13-15.} יתר על כן, RGCs ניתן transfected סלקטיבי על ידי יישום siRNAs, פלסמידים, או וקטורים ויראליים לסוף חתך של עצב הראייה ^16-19 או וקטורים הזרקה לתוך היעד שלהם colliculus מעולה ^10. הדבר מאפשר לחוקרים לבחון מנגנונים אפופטוטיים באוכלוסייה העצבית נפגע ללא תופעות בלבול על נוירונים אחרים או עובר אורח גליה שמסביב. RGC אפופטוזיס יש מאפיין זמן כמובן לפיה מוות של תאים מתעכב postaxotomy 3-4 ימים, אחרי אשר התאים להידרדר במהירות. זה מספק חלון מניפולציות ניסיוני נגד מסלולים מעורב אפופטוזיס. מניפולציות ישירות היעד RGCs מן הגדם transected עצב הראייה מבוצעים בזמן axotomy, מיד לאחר חיתוך העצב. לעומת זאת, כאשר חומרים מועברים דרך המסלול התוך עיני, הם יכולים להיות מוזרק לפני הניתוח או בתוך 3 הימים הראשונים לאחר הניתוח, שלפני תחילת אפופטוזיס RGCs axotomized. במאמר הנוכחי, אנחנו מדגימים כמה שיטות ניסיוניות מניפולציות לאחר חיתוך רוחב עצב הראייה.

Protocol

1. טכניקה כירורגית

1. ניסויים אמור להתבצע באמצעות הטכניקה aseptic ובעקבות השימוש בבעלי חיים פרוטוקולים של המוסד הספציפי שלך. כלים וחומרים (פתרונות, חומרים הבדיקה, קליעים נותבים, מחטים וכו '), לבוא במגע עם רקמה חיה חייב להיות סטרילי כדי למנוע זיהום משפיע לרעה על רווחת בעלי החיים ואת ההשפעות השליליות האפשריות של המחקר.

2. הרדמה

1. חולדות יהיה מורדם באמצעות מערכת אידוי isoflurane וטרינרי. השתמש חמצן כיתה רפואי בשיעור של 0.8 L / min כדי לאדות את הגז isoflurane. מניחים את החיה בתיבת הרדמה מצורף חיוג בריכוז isoflurane של 4% עד הנשימה הואט ובעלי חיים הוא שקט ורגוע.
2. לאחר מכן, לעבור את זרימת הגז המצורף מסיכת הגז למסגרת stereotaxic והמקום חיה במנגנון stereotaxic. הפעל את הריכוז isoflurane עד 2% ולפקח הרדמה. בעלי חיים גדולים יותר (> 300 גרם) עשוי לדרוש ריכוז גבוה של isoflurane. הרדמה צריכה להיות במעקב במהלך הניתוח מינון isoflurane בהתאם. עומק וקצב הנשימה יש להעריך כל הזמן, קמצוץ הערכה הבוהן (כל 5 דקות) על היעדרו של כאב עמוק יש לבצע.
3. לאחר הניתוח הושלם, לכבות את isoflurane ולאפשר את בעל החיים חמצן נשימה למשך מספר דקות לפני הסרת מהמכשיר stereotaxic. טמפרטורת הגוף צריך להיות מתוחזק על ידי מכסה את חיה עם שמיכה כירורגי ו / או באמצעות שמיכה חימום מוסדר במהלך הניתוח.

3. מזרק הכנה זריקות עינית

1. ראשית, להרכיב את מערכת מזרק עבור ביצוע זריקות התוך עיני. 10 μL RN Gastight 1701 המילטון מזרק משמש להזרקה. הסר את כל מחט או בהווה RN אגוז על קצה המזרק.
2. הכנס את טבעת חזוק PFA לכוס הצצה טבעת חזוק של הולם את הדחיסה. ואז להכניס את הולם שלם לתוך בסוף המזרק ואת בורג רופף האגוז RN מעל.
3. הכנס קצה אחד של הצינור הצצה 1 / 16 אינץ' לתוך מתאים דחיסה, דרך הפתח אגוז RN. ודא צינורות הצצה מוכנס היטב. הדקו את הבורג RN כדי לדחוס את טבעת חזוק, איטום צינורות הצצה.
4. בצע שלב 3.2 בשני הקצוות של מצמד כפול RN זכוכית. צרף את הקצה החופשי של הצינור הצצה בקצה אחד של מצמד כפול RN זכוכית על ידי הידוק אגוז RN.
5. Micropipette זכוכית משך יהוו את המחט חבית למערכת ההזרקה. השתמש ב 1.5 מ"מ OD צינורות זכוכית עבה חומה נימי לפברק את pipettes זכוכית, להוסיף את פיפטה זכוכית לתוך הקצה החופשי של מצמד כפול RN זכוכית. הדקו את הבורג RN לתקן את פיפטה במקום.
6. הטיפ קנס של micropipettes זכוכית משך הוא בדרך כלל קטן מדי לביצוע זריקות התוך עיני. כדי ליצור קצה בקוטר המתאים, לשבור את קצה פיפטה הזכוכית תחת הדרכתו ויזואלי, באמצעות מיקרוסקופ כירורגי. סוף חלבית של שקופית הדגימה זכוכית מתאים גם לשבור את פיפטה. החזק את הפיפטה בזווית לשפשף את קצה לאורך ציפוי הזכוכית כדי ליצור הפסקה. באופן אידיאלי, קצה הסופי צריך להיות המשופעים מעט. זה עלול לקחת כמה ניסיונות לייצר עצה טובה, כך למשוך pipettes מרובים לפני השימוש.
7. מערכת הזרקה הוא הידראולי. לכן, מזרק, צינור מקשר הצצה, מצמד כפול RN הזכוכית micropipette זכוכית חייב להיות מלא שמן מינרלי לפני השימוש. שימוש בערכה תחול מ המילטון מזרק ושות' (PRMKIT), למלא את המזרק תחול עם שמן מינרלי. שימוש במחט בקוטר גדול כדי לאפשר מעבר קל של שמן צמיגי. החלף את המחט עם המחט המילטון 90030 שמתאים בתוך חבית של מזרק 10 המילטון μL. בשלב הבא, במקום מחצה גומי על המחט המילטון 90030, על מנת לספק חותם בזמן הזרקת שמן מינרלי.
8. הכנס את המחט 90030 המילטון של המזרק תחול לחלק האחורי של קנה את המזרק 10 המילטון μL של מערכת ההזרקה. לחצו על מחצה בחוזקה בסוף המזרק ליצור חותם.
9. לאט לאט לוחץ על המתג. תראה את שמן מינרלי לעבור דרך זכוכית אלמנטים של מערכת הזרקה, ולבסוף ממלא את פיפטה מזכוכית. דחוף את כל השמן דרך מערכת הזרקה על מנת להסיר כל בועות האוויר לאורך דרכי. אם מזרק מילוי אוזל שמן מינרלי, לאט למשוך את מחט תוך הזמן מחלק הנפט כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. מילוי במזרק תחול ולהזריק שוב.
10. כאשר המערכת כולה מלא שמן מינרלי בועה חינם, הכנס את הבוכנה המקורית של מזרק 10 המילטון μL. לוחץ על המתג עד סוף הנסיעה שלה כדי להסיר שמן מינרלי נוספים מהמערכת. נגבו את micropipette זכוכית נקי סוף המזרק נקי עם אתנול 70%.
11. Withdraw על הבוכנה של המזרק כדי לסמן 2 μL על החבית. סוף micropipette הזכוכית ימלא עם אוויר מתן אזור חיץ בין שמן מינרלי הנוזל הרצוי להיות מוזרק. חבית פיפטה כעת ניתן למלא על ידי הנחת סוף micropipette בפתרון הרצוי משיכת הבוכנה של המזרק המילטון. אין להזריק יותר מ 4-5 μL של פתרון לתוך העין עכברוש מבוגר.

4. הזרקת נוהל תוך עיני: מיקוד על הרשתית גלובלי

1. עם החיה הרדים ומאובטחת במסגרת stereotaxic (כפי שמתואר בסעיף 2), יש להשתמש בטיפות עיניים Alcaine כדי topically להרדים את הקרנית. פתח את העפעפיים עם האצבעות ואת המקום טיפה אחת של פתרון ההרדמה על פני השטח של הקרנית.
2. הזרקת דורש שני אנשים: אחד להכניס את פיפטה זכוכית לתוך תא זגוגי ולשמור עמדה פיפטה, ודבר אחר הוא לוחץ על המתג על המזרק אשר מספק את הפתרון הרצוי.
3. אחיזה תחת מיקרוסקופ כירורגי, הזכוכית micropipette ו כפול מצמד RN זכוכית עם האצבעות. מורחים את העפעפיים עם אצבעות יד חופשית שלך, ויצרו "V" הצורה מול הזריקה. באמצעות הפעלת כוח משיכה על העפעפיים, העין יהיו גבוהות מחוץ למסלול, חושף את פני השטח האחורי מאחורי לימבוס. על ידי יצירת "V" צורה עם האצבעות מול הזריקה, עריסה נוצר עבור העין מתן יציבות כאשר מזריקים.
4. הכנס בעדינות את קצה micropipette הזכוכית דרך הלחמית, באזור ללא כלי דם, ודרך בלובן העין, בזווית כלפי מטה. אתה צריך להרגיש "פופ" קטן כאשר פיפטה חודר בלובן העין. הכנסת פיפטה בזווית מעט כלפי מטה מפחית את הסיכוי להכות את העדשה כאשר החדרת המחט.
5. האדם מחזיק את המזרק צריך עכשיו להזריק את μL 4 של פתרון מדכא את הבוכנה כדי לסמן 2 μL על המזרק. הזריקה צריכה לקחת כ 1-2 שניות בסך הכל. הזרקת בקצב איטי מאוד> 3 שניות מפחיתה את התפשטות הראשונית של הפתרון באמצעות תא זגוגי. תוכל לראות את פתרון מוזרק שטיפה באמצעות תא זגוגי תחת מיקרוסקופ, ובכך לאמת את ההצלחה של ההליך.
6. החזק את micropipette יציב למשך כ 5 שניות ולאחר מכן לסגת, בכיוון זהה את המחט הוכנס. לחמית יהיה דש בחזרה מעל הפתח הקטן, עוזר לאטום את לנקב scleral.
7. מכסים את פני השטח של הקרנית עם משחת עיניים בעיניים (דמעות Naturale PM) על מנת למנוע התייבשות הקרנית במהלך ההתאוששות, ולהשיב את בעל החיים בכלוב התאוששות.
8. משככי כאבים לאחר ניתוח צריכה להינתן על פי ההנחיות של טיפול בבעלי חיים שלך הרשויות ובעלי חיים צריכים להיות במעקב צמוד לאחר הניתוח.

5. מיקוד סלקטיבי לתאי הגנגליון ברשתית מן הגדם עצב הראייה

1. יישום קליעים נותבים, סמים, פלסמידים, siRNAs או וקטורים ויראליים אל גדם העצב האופטי, בעקבות axotomy, ישירות לתאי הגנגליון ברשתית מטרות באמצעות תחבורה מדרדר. מטרה זו מושגת על ידי הראשון ביצוע חיתוך רוחב עצב הראייה על פי "פרוטוקול חיתוך רוחב אופטיים עצב" ^22.
2. ישנן שתי שיטות עיקריות לביצוע הליך זה: שימוש gelfoam, או הזרקה ישירה לתוך עצב הראייה.
3. השיטה gelfoam דומה מדרדר מעקב, לעומת זאת, כאשר מתן טיפולים ניסיוניים על עצב הראייה רצוי תווית מראש בתאי הגנגליון של הרשתית באמצעות הזרקת קליעים נותבים נסוג לתוך שבוע מעולה 1 colliculus לפני axotomy. זה חשוב עבור תא התחקות כי, במקרים מסוימים קליעים נותבים עצבי יכול להפריע התחבורה מדרדר של חומרים ניסיוניים או להיפך.
4. מיד לאחר עצב הראייה היא לחתוך, חתיכה קטנה של gelfoam ספוגה פתרון הניסוי ממוקם מעל הגדם transected עצב הראייה. תוכן מסלולית מוחזרים אז למיקום הקודם שלהם. כאשר העין הוא חזר לעמדה ניטרלית יש צורך להשתמש במלקחיים כדי לדחוף את פיסת gelfoam למטה למסלול, כדי להבטיח שהוא נשאר על סוף עצב הראייה.
5. טכניקת ההזרקה יעילה יותר עבור משלוח של חומרים שצריכים לקבל גישה הציטופלסמה של האקסון כדי להיות מועבר על ידי זרימת retrogradely האקסופלזמית. זה כולל siRNAs ו פלסמידים, ובמקרים מסוימים וקטורים ויראליים. מזרק 5-10 μL המילטון משמש להזריק את הפתרון הרצוי לתוך עצב הראייה transected.
6. גריפ קצה עצב הראייה עם קנס קצה דומון מלקחיים. הכנס את הקצה של המחט לתוך עצב הראייה, במקביל העצב, עד שפוע כבר אינו נראה לעין. המחט הוכנס יהיה עטוף מכל צדדיו העצב. מחט עם שפוע קצר רצוי.
7. לאחר needle מוכנס לתוך העצב, ללחוץ בעדינות בצידי העצב עם מלקחיים קצה בסדר להזריק 1 / 4 של הפתרון בעוד סיבוב מזרק אחד בתורו הרבעון עם כיוון השעון או נגד כוון השעון.
8. המשך לחזור על שלב 5.7 עד שתשלים סיבוב מלא של המחט והזריק את כל תכולת המזרק. לקבלת התוצאות הטובות ביותר להזרים סך של 10 μL של פתרון באמצעות gastight 10 μL מזרק המילטון.
9. הסר את קצה המזרק מן העצב. השאירו את הנוזל מוזרק עודף כי יש refluxed מן העצב בתוך מסלול כמו זה יהוו בריכה נוספת על ידי ספיגת קצות האקסונים.
10. החזר את התוכן מסלולית למיקום המקורי שלהם, לסגור את הפצע, ולאפשר החיה להתאושש.
11. משככי כאבים לאחר ניתוח צריכה להינתן על פי ההנחיות של טיפול בבעלי חיים שלך הרשויות ובעלי חיים צריכים להיות במעקב צמוד לאחר הניתוח.

6. נציג תוצאות:

זריקות תוך עיניות היעד כל התאים ברשתית ברחבי העולם, פועלות היטב עבור החומרים למסירה RGCs נפצעו מאז בתאי הגנגליון נמצאים בשכבה הפנימית ביותר של נוירונים ברשתית, סמוך לחדר זגוגי. RGCs יכול גם להיות ממוקד ישירות על ידי אספקת חומרים על גדם העצב transected הראייה. RGCs Fluorogold שכותרתו retrogradely ניתן למקד באמצעות פפטידים, סמים, ווקטורים, פלסמידים, או siRNAs מ גדם העצב כמו באיור 1. איור 1A-C מדגים את הלוקליזציה של פפטיד שכותרתו Cy3 ב somata של RGCs שהיו טרום שכותרתו ידי הזרקת Fluorogold לתוך colliculus מעולה. Cy3 פפטידים שכותרתו הוזרקו עצב הראייה מיד לאחר axotomy, ואת הרשתית היה צילמו בחיים כדי למנוע את הפפטידים של שטיפת מתוך הרקמה במהלך קיבעון. איור 1D-F מדגים את הלוקליזציה של Cy3 siRNAs שכותרתו ואת נותב מדרדר Fluorogold ב RGCs axotomized. Cy3 siRNAs שכותרתו הוזרקו הגדם עצב הראייה מיד לאחר axotomy, ואת הרשתית היה צילמו בחיים.

באיור 1. Micrographs Epifluorescence של RGCs ב הרשתיות flatmounted ביום 1 לאחר axotomy ו הזרקת או פפטידים או siRNAs שכותרתו לתוך הגדם עצב הראייה. (א) Fluorogold תיוג מדרדר ב RGCs axotomized ב postaxotomy 1 היום (ב ') Cy3 הקרינה RGCs הבאים תחבורה מדרדר של פפטידים שכותרתו, 1 יום אחרי axotomy הזרקת הפפטיד לתוך עצב הראייה. (ג) כיסוי של (א) ו - (ב) הוכחת לוקליזציה סלקטיבית של Cy3 פפטידים שכותרתו RGCs שכותרתו Fluorogold. (DF) גופותיהם של התא RGCs שכותרתו Fluorogold (ד ') הם מילאו גם עם Cy3 siRNAs שכותרתו (E) שהוחדר לתוך הגדם עצב הראייה 24 שעות קודם לכן, כפי שמוצג כיסוי (F). בר סולם ב AC הוא 50 מיקרומטר. בר סולם ב DF הוא 20 מיקרומטר.

Discussion

חיתוך רוחב עצב הראייה הוא מודל לשחזור ביותר של אפופטוזיס CNS מבוגר נוירון. מניפולציות הניסוי הפגינו כתב היד הזה היתר חקר מנגנוני אפופטוזיס RGC לאחר פציעה.

זריקות תוך עיניות שימושיים המיקוד העולמי של הרשתית. הליך זה דורש קצת תרגול, כפי שהוא קריטי לא לפצוע את העדשה עם קצה פיפטה מזכוכית. נזק עדשה הוכח לגרום לשחרור גורמי צמיחה, שינוי הישרדות התא התחדשות ^{20, 21.} זה חשוב גם בזהירות להוסיף למשוך את פיפטה זכוכית במקביל לכיוון קצה. כל הכוח לרוחב על קצה פיפטה מזכוכית יכול לגרום שבר זכוכית להיכנס לתא זגוגי נזק העדשה או הרשתית. בעזרת פיפטה עם טיפ זה בסדר גם לא יכול להתיר את המסירה של פתרונות צמיג. יתר על כן, טיפ נאה מאוד לא לתת משוב משושי כאשר בלובן העין הוא ניקב מגדילים את הסיכוי ניקוב בטעות את העדשה. העדשה צריכה להישאר ברורה ללא כל סימני דקירה, כאשר נצפו במיקרוסקופ. אם העדשה פגומה, קטרקט לעיתים קרובות הטופס העדשה יהיה ענן מעל אלה תוצאות הניסוי צריך להיות מורחק.

מערכת מזרק עובד הכי טוב כאשר אין בועות אוויר נוכח לאורך דרכי. האוויר יכול להתרחב לדחוס ולהקטין את ההיענות של נסיגה פתרון או מסירה. אם בועות אוויר נראים, שטוף אותם עם המזרק תחול ושמן מינרלי. מתאם זכוכית כפולה RN עם אביזרי דחיסה עושה שינוי פיפטה יעילה בין בעלי חיים, טיפולים שונים, או במקרה של שבירה. מערכת זו היא החזקה תימשך שנים רבות לפני מתנוצץ בחישוקי המתכת שלהם צריך להיות מוחלף, כל עוד pipettes מוכנסים בזהירות.

מיקוד RGCs ישירות על ידי הזרקת עצב הראייה היא הליך מהיר למדי עם כמה אזהרות. אם הגדם עצב הראייה הוא קצר מדי, זה עושה זריקות קשות. גדם קצר גם מגדיל את הסיכוי כי המחט יפגע כלי רשתית ליד ראש עצב הראייה כפי שהוא מוכנס לרמה של שפוע. כך, גזע כרות עצב הראייה של כ -2 מ"מ אורך רצוי בעת ביצוע זריקות עצב עם טכניקה זו. הזריקות העבודה הטובה ביותר כאשר שפוע של המזרק מוקף לחלוטין בתוך עצב הראייה. יש להקפיד לא לעבור את קצה מחט דרך הצד של העצב כמו זה יוצר אזור של התנגדות נמוכה, דבר המאפשר נוזל ליציאה באתר ההזרקה ובכך להקטין את האפקטיביות של הזריקה.

כאשר עובדים עם פוטנציאל biohazards כגון חלקיקים נגיפיים או תאים טרנספורמציה, חשוב לעקוב אחר הנחיות מוסדיים נהלי הבטיחות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.
Rat Gas Mask	Stoelting Co.
Anesthesia System	VetEquip	901806
Isoflurane (PrAErrane)	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
Surgical Microscope	WPI, Zeiss, Leica
Alcaine Eye Drops	Alcon
Tears Naturale P.M.	Alcon
Fine tip Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-00
10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2)	Hamilton Co	80030
1/16 inch Compression Fittings	Hamilton Co	55751-01
1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing	Supelco, Sigma-Aldrich	Z226661
Dual RN Glass Coupler	Hamilton Co	55752-01
Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa	Hamilton Co	PRMKIT