Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Методы экспериментальных манипуляций после оптические Перерезка нерва в ЦНС млекопитающих

Published: May 12, 2011 doi: 10.3791/2261
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Surgery, University of Toronto
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Оптические перерезки нерва широко используется модель взрослого травмы ЦНС. Эта модель идеально подходит для проведения ряда экспериментальных манипуляций, нацеленных сетчатки глобально или непосредственно целевой ранения нейронов населения ганглиозных клеток сетчатки.

Abstract

Ганглиозных клеток сетчатки (РГК) в ЦНС нейроны, которые выводят визуальную информацию от сетчатки в мозг через зрительный нерв. Зрительного нерва могут быть доступны в орбите глаза и полностью перерезана (axotomized), резки аксоны весь РГК населения. Оптические перерезки нерва воспроизводимые модели апоптоза нейронов гибель клеток во взрослом ЦНС 1-4. Эта модель особенно привлекательна тем, стекловидное камеры глаза действует как капсулы для доставки лекарств к сетчатке, что позволяет с помощью экспериментальных манипуляций внутриглазных инъекций. Диффузии химических веществ через стекловидное жидкости гарантирует, что они действуют на весь РГК населения. Вирусные векторы, плазмиды или короткий вмешательства РНК (siRNAs) также могут быть доставлены в стекловидной камере для того, чтобы заразить или трансфекции клеток сетчатки 5-12. Высокий тропизм адено-ассоциированные вирус (AAV) векторов выгодно для целевой РГК, с инфекцией ставка приближается к 90% клеток вблизи места инъекции 6, 7, 13-15. Более того, РГК могут быть выборочно трансфекции с применением siRNAs, плазмиды или вирусные векторы, чтобы сократить конце зрительного нерва 16-19 или инъекционные векторы в своей целевой верхний бугорок 10. Это позволяет исследователям изучать механизмы апоптоза в поврежденных нейронов населения, не смешивая воздействия на другие нейроны свидетеля или окружающей глии. RGC апоптоз имеет характерное время курс которой гибель клеток задерживается 3-4 postaxotomy дней, после чего клетки быстро вырождается. Это обеспечивает окно для экспериментальной манипуляции направлены против путей, участвующих в апоптозе. Манипуляции, которые нацелены непосредственно на РГК из перерезанного оптических культи нерва выполняются во время axotomy, сразу же после резки нерва. Напротив, когда вещества доставляются внутриглазного маршрута, они могут быть введены до операции или в течение первых 3 дней после операции, предшествующие началу апоптоза в axotomized РГК. В настоящей статье мы покажем несколько методов для экспериментальных манипуляций после перерезки оптический нерв.

Protocol

1. Хирургическая техника

  1. Эксперименты должны проводиться с использованием асептических условиях и после использования животных протоколов вашего конкретного учреждения. Инструменты и материалы (растворы, испытание веществ, трейсеры, иглы и т.д.) вступления в контакт с живой ткани должны быть стерильными, чтобы предотвратить инфекцию и негативного воздействия на животных и потенциального негативного воздействия на исследование.

2. Анестезия

  1. Крысы будут наркозом использованием ветеринарных изофлуран системы испарителем. Использование медицинского кислорода класса со скоростью 0,8 л / мин для испарения изофлуран газа. Место животных в приложенном поле анестезии и набрать в изофлуран концентрации 4% до дыхание замедлилось, и животное степенный.
  2. Затем переключатель потока газа в привязанности противогаз для стереотаксической рамы и место животного в стереотаксического аппарата. Включите изофлуран концентрации до 2% и мониторинг анестезии. Большие животные (> 300), может потребоваться более высокая концентрация изофлуран. Анестезия должна контролироваться во время операции и изофлуран дозировка корректируется. Глубина и частота дыхания должна постоянно оцениваться и ног щепотку оценки (каждые 5 минут) за отсутствие глубокой боли должны быть выполнены.
  3. Как только операция завершится, выключите изофлуран и позволяют животному дышать кислородом в течение нескольких минут до снятия с стереотаксического устройства. Температура тела должна быть сохранена, покрывая животное с хирургической одеяло и / или с использованием регулируемых одеяло отопления во время операции.

3. Шприц Подготовка к Внутриглазное Инъекции

  1. Во-первых, собирать шприц системы для выполнения внутриглазных инъекций. 10 мкл RN Газонепроницаемый 1701 Гамильтон Шприц используется для инъекций. Удалите иглу или RN гайки присутствуют на конец шприца.
  2. Вставьте PFA наконечником в чашку PEEK наконечником компрессионный фитинг. Затем вставьте полной установки в конце шприца и свободно винт гайка РН по вершине.
  3. Вставьте один конец 1 / 16 дюйма PEEK трубку в резьбовое, через отверстие в гайке RN. Убедитесь в том, PEEK трубки упора. Затяните гайку RN сжать наконечником, запечатывание PEEK трубки.
  4. Выполните шаг 3.2 на обоих концах двойной муфты стекла RN. Прикрепите свободный конец трубки PEEK к одному концу Двойная муфта стекла RN, затянув гайки RN.
  5. Вытащил стекло микропипетки сформирует иглы и ствол для системы впрыска. Используйте 1,5 мм OD толстостенных стеклянных капиллярных трубок для изготовления стеклянной пипетки и вставить стекла пипетки в свободный конец Двойная муфта стекла RN. Затяните гайку RN исправить пипетки на месте.
  6. Штрафа кончике микропипетки вытащил стекло, как правило, слишком малы для выполнения внутриглазного инъекций. Для того чтобы создать кончик соответствующего диаметра, сломать кончик стеклянной пипетки под визуальным руководством, с использованием операционного микроскопа. Замороженный конец слайд образца стекла хорошо подходит для перерыва пипетки. Держите пипетку в угол и втирать наконечник вдоль стеклянной глазурью для создания перерыва. В идеале, последний совет должен быть слегка скошены. Это может занять несколько попыток получить хороший совет, так что тянуть несколько пипеток перед использованием.
  7. Система впрыска гидравлический. Таким образом, шприц, компоновщик PEEK трубы, двойные стекла RN муфтой и стеклянные микропипетки должны быть заполнены минеральным маслом перед использованием. Использование Грунтовка комплект из Гамильтона Шприц Ко (PRMKIT), заполните грунтовки шприц с минеральным маслом. Использование большого диаметра иглы, что позволяет легко прохождения вязкого масла. Замените иглу с Гамильтоном 90030 иглы, которая помещается внутрь ствола 10 мкл шприце Hamilton. Далее, поместите резиновую перегородку над Гамильтон 90030 иглы, с тем чтобы обеспечить печать в результате употребления инъекционных нефтепродуктов.
  8. Вставьте Гамильтон 90030 иглу шприца грунтовки в заднюю часть ствола 10 мкл шприца Гамильтона системы впрыска. Пресс перегородки вплотную конце шприца для создания уплотнения.
  9. Медленно нажмите поршень. Вы увидите проход минеральное масло через стеклянные элементы системы впрыска и, наконец, заполнение стеклянной пипетки. Нажмите все масло через систему впрыска для того, чтобы удалить пузырьки воздуха вдоль тракта. Если заполнение шприца на исходе нефтепродуктов, медленно извлеките иглу, постоянно дозирования масла для предотвращения образования пузырьков воздуха. Пополнить грунтования шприц и вводят снова.
  10. Когда вся система заполнена минеральным маслом и пузырь бесплатно, вставить оригинальный поршень шприца 10 мкл Hamilton. Нажмите на поршень до конца своего путешествия, чтобы удалить дополнительные минеральные масла из системы. Протрите стекло микропипетки чистой и конец шприца чистой с 70% этанола.
  11. Withdraш поршень шприца на 2 мкл отпечаток на баррель. Конец стеклянной микропипетки будет наполнить воздухом обеспечения буферной зоны между нефтепродуктов и желаемую жидкость для инъекций. Баррель пипетки теперь может быть заполнена путем размещения конце микропипетки в искомое решение и снять поршень шприца Гамильтона. Не вводить более 4-5 мкл раствора в глаза взрослой крысы.

4. Внутриглазное Процедура инъекции: Ориентация Retina Глобально

  1. С животных под наркозом и закреплены в стереотаксической рамы (как описано в разделе 2), воспользуйтесь Alcaine глазные капли, чтобы местно обезболить роговицы. Открытые веки пальцами и место одна капля анестетика раствора на поверхности роговицы.
  2. Инъекция требуется два человека: один, чтобы вставить стекло пипетки в полости стекловидного тела и поддерживать позицию пипетки, а другой опускают поршень шприца на который доставляет искомое решение.
  3. Под операционного микроскопа, сцепление стеклянной микропипетки и двойного стекла RN ответвитель пальцами. Распространение веки пальцами свободной руки, образуя "V" формы противоположном месте инъекции. Применяя тяги к веки, глаза будут повышенные из орбиты, подвергая задней поверхности за лимба. Создавая "V" формы с пальцами противоположной месте инъекции, колыбель формируется для глаз обеспечение стабильности при внутривенном введении.
  4. Осторожно введите кончик стеклянной микропипетки через конъюнктиву, в области, лишенной кровеносных сосудов, и через склеру, в нисходящий угол. Вы должны почувствовать небольшую "поп", когда пипетки проникает склеры. Вставка пипетки на немного вниз угол уменьшает шансы попасть объектив при установке иглы.
  5. Лицо, занимающее шприц должен теперь вводят 4 мкл раствора, нажав на поршень 2 мкл след в шприц. Инъекция должна примерно от одного до двух секунд, в общей сложности. Потребители инъекционных на очень медленном темпе> 3 секунды уменьшает первоначальное распространение раствора через стекловидное камеры. Вы сможете увидеть введенного раствора промывки через стекловидное камере под микроскопом, тем самым проверки успех процедуры.
  6. Держите микропипетки устойчивый в течение примерно 5 секунд, а затем снять, в том же направлении, что и вводилась игла. Конъюнктивы будет лоскут назад на небольшое отверстие, помогая уплотнения склеры прокол.
  7. Обложка поверхности роговицы глаз глазной мазью (Слезы Naturale PM), чтобы предотвратить высыхание роговицы во время восстановления, и вернуть животное к восстановлению клетки.
  8. Послеоперационные анальгетики следует назначать в соответствии с руководящими принципами вашей власти по уходу за животными, а животные должны быть тщательно проверены после операции.

5. Выборочно Ориентация ганглиозных клеток сетчатки с оптической Пень Нервные

  1. Применение индикаторов, наркотики, плазмиды, siRNAs или вирусных векторов зрительного нерва пень, после axotomy, непосредственно цели ганглиозных клеток сетчатки через ретроградного транспорта. Это достигается за счет выполнения первого оптического перерезки нерва в соответствии с "Оптик протокол Перерезка Нервные" 22.
  2. Есть два основных метода для выполнения этой процедуры: с помощью gelfoam, или прямой инъекции в зрительный нерв.
  3. Метод gelfoam похож на ретроградной трассировки, однако при доставке экспериментального лечения в глазной нерв желательно предварительно этикетке ганглиозных клеток сетчатки путем введения ретроградной трейсеров в верхний бугорок за 1 неделю до axotomy. Это важно для мобильных трассировки, поскольку в некоторых случаях нейронов индикаторов может помешать ретроградного транспорта экспериментальных веществ или наоборот.
  4. Сразу же после зрительного нерва режется, маленький кусочек пропитанной gelfoam экспериментального решения находится над пересекаются оптические культи нерва. Орбитальной содержимое затем вернулись в свои предыдущие места. Когда глаз возвращается в нейтральное положение, необходимо использовать щипцы подтолкнуть часть gelfoam вниз на орбиту, гарантируя, что он остается на конце зрительного нерва.
  5. Техника инъекции является более эффективным для доставки веществ, которые должны получить доступ к цитоплазме аксона, чтобы быть ретроградно транспортируется axoplasmic потока. Это включает в себя siRNAs и плазмиды, а в некоторых случаях вирусных векторов. 5-10 мкл шприца Гамильтона для инъекций искомое решение в перерезанного зрительного нерва.
  6. Возьмитесь за края зрительного нерва с тонкой наконечником Дюмон щипцами. Вставьте конец иглы в зрительный нерв, параллельно с нервом, пока конических больше не видна. Вставляется игла будет заключенный со всех сторон нерва. Игла с коротким конических желательно.
  7. Как только яeedle вставляется в нерв, слегка сжать стороны нерва с тонкой пинцетом и вводят наконечник четверть решение, одновременно вращая шприц на четверть оборота по часовой стрелке или против часовой стрелки.
  8. Продолжить повторять Шаг 5,7 до завершения полного вращения иглы и вводят все содержимое шприца. Для достижения наилучших результатов вводят в общей сложности 10 мкл раствора с использованием газонепроницаемый шприц 10 мкл Hamilton.
  9. Удалите наконечник шприца от нервов. Оставьте избыток вводимой жидкости, которое кипятят с нерва в пределах орбиты так как это форма дополнительного бассейн для поглощения концах аксонов.
  10. Вернуться орбитальной содержания в исходное положение, закройте рану, и позволяют животному, чтобы оправиться.
  11. Послеоперационные анальгетики следует назначать в соответствии с руководящими принципами вашей власти по уходу за животными, а животные должны быть тщательно проверены после операции.

6. Представитель Результаты:

Внутриглазное инъекции цель всех клеток в сетчатке в глобальном масштабе, и хорошо подходят для доставки веществ пострадавшим РГК с ганглиозные клетки находятся в самом внутреннем слое нейронов сетчатки, прилегающей к полости стекловидного тела. РГК также может быть непосредственно направлены на доставку веществ пересекаются оптические культи нерва. Fluorogold ретроградно меченых РГК могут быть направлены использованием пептидов, наркотики, векторы, плазмиды или siRNAs от нервов культи, как показано на рисунке 1. Рисунок 1А-C демонстрирует локализацию Cy3 меченых пептидов в somata из РГК, которые были предварительно помечены инъекционных Fluorogold в верхний бугорок. Cy3 меченых пептидов вводили в зрительный нерв сразу после axotomy, и сетчатка отображаемого в живых, чтобы предотвратить пептидов в результате вымывания из ткани во время фиксации. Рис. 1D-F демонстрирует локализацию Cy3 помечены siRNAs и ретроградной трассирующими Fluorogold в axotomized РГК. Cy3 помечены siRNAs вводили в зрительный нерв пень сразу после axotomy, и сетчатка отображаемого жив.

Рисунок 1
Рисунок 1. Epifluorescence микрофотографии РГК в flatmounted сетчатки на 1 день после axotomy и инъекция либо меченых пептидов или siRNAs в зрительном культи нерва. (А) Fluorogold ретроградной маркировки в axotomized РГК на 1 день postaxotomy (B) Cy3 флуоресценции в РГК следующие ретроградной транспорта меченых пептидов, 1 день после axotomy и пептид инъекции в зрительный нерв. (C) Наложение (А) и (Б) демонстрации селективной локализации Cy3 меченых пептидов в Fluorogold помечены РГК. (DF) клеточных тел Fluorogold помечены РГК (D) также заполнены Cy3 помечены siRNAs (E) вводится в зрительный нерв пень 24 часов раньше, как показано на оверлей (F). Шкала бар в переменного тока составляет 50 мкм. Шкала бар в DF составляет 20 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Оптические перерезки нерва высокой воспроизводимостью модель взрослого апоптоза нейронов ЦНС. Экспериментальных манипуляций продемонстрировали в этой рукописи позволяют изучить механизмы апоптоза РГК после травмы.

Внутриглазное инъекции полезны для глобальной ориентации сетчатки. Эта процедура требует некоторой практики, как важно, чтобы не повредить объектив с кончик стеклянной пипетки. Объективы повреждение было показано, что вызвать высвобождение факторов роста, изменение выживаемости клеток и регенерацию 20, 21. Кроме того, важно тщательно вставить и вывести параллельную стеклянную пипетку, чтобы направление наконечника. Любые боковая сила на кончике стеклянной пипетки может привести фрагмент стекла, чтобы войти в стекловидной камере повреждения линзы или сетчатки. Использование пипетки с наконечником, который является слишком штрафа не может разрешить доставку вязкие растворы. Кроме того, чрезвычайно тонкий наконечник не дает тактильной обратной связи, когда склеры проколот увеличивая риск случайного прокола линзы. Линза должна оставаться чистой и свободной от любых марок прокола при наблюдении под микроскопом. Если линза повреждена, катаракта часто форма и объектив облако, и эти результаты эксперимента должны быть исключены.

Шприц система работает лучше всего, когда Есть нет воздушных пузырей присутствует наряду тракта. Воздух может расширяться и сжиматься снижения отзывчивости о выходе решения или доставки. Если воздушные пузыри видны, промойте их с шприц грунтовки и нефтепродуктов. Двойное стекло RN адаптер с компрессионные фитинги делает изменения пипетки эффективным между различными животными, лечение, или в случае поломки. Эта система является надежной и будет длиться много лет, прежде наконечники должны быть заменены, при условии, пипетки тщательно вставлена.

Непосредственно ориентации РГК, вводя зрительного нерва является довольно быстрая процедура с некоторыми оговорками. Если зрительный нерв пень слишком коротка, он делает инъекции сложно. Короткая культя также повышает вероятность того, что игла может повредить сосуды сетчатки вблизи зрительного нерва, как он вставляется уровень фаски. Таким образом, зрительный нерв пень около 2 мм в длину, желательно при выполнении нерва инъекции с этой техникой. Инъекции работают лучше, когда скос шприц полностью закрыт в течение зрительного нерва. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не проходить иглы через сторону нерва, поскольку это создает области низкого сопротивления, что позволяет жидкости, чтобы выйти из места инъекции тем самым снижая эффективность инъекций.

При работе с потенциальными биологической опасности, таких как вирусные частицы или трансформированные клетки, важно следовать институциональных принципов и процедур безопасности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

PDK поддерживается операционной CIHR гранта (СС 86523)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereotaxic Frame Stoelting Co.
Rat Gas Mask Stoelting Co.
Anesthesia System VetEquip 901806
Isoflurane (PrAErrane) Baxter Internationl Inc. DIN 02225875
Surgical Microscope WPI, Zeiss, Leica
Alcaine Eye Drops Alcon
Tears Naturale P.M. Alcon
Fine tip Dumont forceps Fine Science Tools 11252-00
10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2) Hamilton Co 80030
1/16 inch Compression Fittings Hamilton Co 55751-01
1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing Supelco, Sigma-Aldrich Z226661
Dual RN Glass Coupler Hamilton Co 55752-01
Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa Hamilton Co PRMKIT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).
  2. Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration. Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).
  3. Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).
  4. Weishaupt, J. H., Bahr, M. Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system - molecular death and survival pathways. Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).
  5. Arai-Gaun, S. Heme oxygenase-1 induced in muller cells plays a protective role in retinal ischemia-reperfusion injury in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 4226-4232 (2004).
  6. Bainbridge, J. W., Tan, M. H., Ali, R. R. Gene therapy progress and prospects: the eye. Gene Ther. 13, 1191-1197 (2006).
  7. Polo, A. D. i Prolonged delivery of brain-derived neurotrophic factor by adenovirus-infected Muller cells temporarily rescues injured retinal ganglion cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 3978-3983 (1998).
  8. Herard, A. S. siRNA targeted against amyloid precursor protein impairs synaptic activity in vivo. Neurobiol Aging. 27, 1740-1750 (2006).
  9. Koeberle, P. D., Bahr, M. The upregulation of GLAST-1 is an indirect antiapoptotic mechanism of GDNF and neurturin in the adult CNS. Cell Death Differ. 15, 471-483 (2008).
  10. Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125, 903-920 (2004).
  11. Naik, R., Mukhopadhyay, A., Ganguli, M. Gene delivery to the retina: focus on non-viral approaches. Drug Discov Today. 14, 306-315 (2009).
  12. van Adel, B. A. Delivery of ciliary neurotrophic factor via lentiviral-mediated transfer protects axotomized retinal ganglion cells for an extended period of time. Hum Gene Ther. 14, 103-115 (2003).
  13. Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
  14. Allocca, M. AAV-mediated gene transfer for retinal diseases. Expert Opin Biol Ther. 6, 1279-1294 (2006).
  15. Surace, E. M., Auricchio, A. Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer. Vision Res. 48, 353-359 (2008).
  16. Garcia-Valenzuela, E. Axon-mediated gene transfer of retinal ganglion cells in vivo. J Neurobiol. 32, 111-122 (1997).
  17. Koeberle, P. D., Wang, Y., Schlichter, L. C. Kv1.1 and Kv1.3 channels contribute to the degeneration of retinal ganglion cells after optic nerve transection in vivo. Cell Death Differ. 17, 134-144 (2010).
  18. Kugler, S. Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death. Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).
  19. Lingor, P. Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo. Brain. 128, 550-558 (2005).
  20. Leon, S. Lens injury stimulates axon regeneration in the mature rat optic nerve. J Neurosci. 20, 4615-4626 (2000).
  21. Mansour-Robaey, S. Effects of ocular injury and administration of brain-derived neurotrophic factor on survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 1632-1636 (1994).
  22. D'Onofrio, P. M., Magharious, M. M., Koeberle, P. D. Optic Nerve Transection: A Model of Adult. J Vis Exp. , Forthcoming Forthcoming.

Tags

Neuroscience выпуск 51 центральной нервной системы сетчатки ганглиозных клеток Axotomy оптические Перерезка нерва Внутриглазное инъекций Трансфекция Нервные Стамп вирусный вектор краткосрочный интерферирующих РНК

Erratum

Formal Correction: Erratum: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS
Posted by JoVE Editors on 05/31/2011. Citeable Link.

A correction was made to Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS. There was an error in the order of the authors. The authors ordering has been corrected to:

Philippe M. D'Onofrio, Mark M. Magharious, Paulo D. Koeberle

instead of:

Mark M. Magharious, Philippe M. D'Onofrio, Paulo D. Koeberle

Методы экспериментальных манипуляций после оптические Перерезка нерва в ЦНС млекопитающих
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

D'Onofrio, P. M., Magharious, M. M., … More

D'Onofrio, P. M., Magharious, M. M., Koeberle, P. D. Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS. J. Vis. Exp. (51), e2261, doi:10.3791/2261 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter