哺乳類の中枢神経系における視神経切断後の実験操作のための方法

Summary

視神経切断は、成体中枢神経系の損傷の広く使用されているモデルです。このモデルは、世界的に網膜をターゲットにするか、直接網膜神経節細胞の損傷した神経細胞集団を対象に実験操作の数を実行するための理想的です。

Abstract

網膜神経節細胞は（RGCs）視神経を経由して、網膜から脳にその出力を視覚情報CNSニューロンです。視神経は、全体RGC​​人口の軸索を切断、目と完全にtransected（axotomized）の軌道内でアクセスすることができます。視神経切断は、成体中枢神経系^1-4のアポトーシス神経細胞死の再現可能なモデルです。眼の硝子体腔は眼内注射を介して実験操作を可能にして、網膜への薬物送達のためのカプセルとして機能するので、このモデルは特に魅力的です。硝子体液を介して化学物質の拡散は、彼らが全体のRGCの人口に基づいて行動することを保証します。ウイルスベクター、プラスミドまたは短い干渉RNAは（siRNAが）も^5-12を網膜細胞に感染またはトランスフェクトするために硝子体腔に配信することができます。アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターの高い親和性は、注射部位^{6、7、13-15}近くの細胞の90％に近い感染率で、ターゲットRGCsに有益です。また、RGCsが選択的に標的上丘¹⁰に視神経^16から19または注入ベクトルの切り口にしたsiRNA、プラスミド、またはウイルスベクターを適用することにより、トランスフェクションすることができる。これは、研究者は他のバイスタンダーの神経細胞または周囲のグリア細胞上で交絡の影響なしに負傷した神経細胞集団のアポトーシスのメカニズムを研究することができます。 RGCのアポトーシスは、細胞死、細胞が急速に退化した後、3〜4日のpostaxotomyを遅延さにより時間経過特性を持っています。これは、アポトーシスに関与する経路に対して誘導実験操作のためのウィンドウが用意されています。直接transected視神経の切り株からRGCsをターゲットの操作はすぐに神経を切断した後、軸索切断時に実行されます。これとは対照的に、物質が眼内経路を介して配信されるとき、それらはaxotomized RGCsのアポトーシスの開始の前に、手術前または手術後3日以内に注入することができる。現在の記事では、視神経切断後の実験操作にはいくつかの方法を示しています。

Protocol

1。手術手技

1. 実験は無菌操作を使用して、特定の機関の動物使用のプロトコールに従って実施されるべきである。生体組織と接触する楽器と材料（ソリューション、テスト物質、トレーサー、針、など）動物福祉と研究上の潜在的な負の影響に感染して悪影響を防ぐために無菌でなければならない。

2。麻酔

1. ラットは、獣医イソフルラン気化器のシステムを使用して麻酔になります。イソフルランガスを気化させるために0.8 L / minの速度で、医療グレードの酸素を使用してください。呼吸が鈍化していると動物が落ち着いたようになるまで4％のイソフルラン濃度で接続されている麻酔ボックスとダイヤルで動物を置きます。
2. 次に、定位フレーム用ガスマスクの添付ファイルへのガスの流れを切り替え、定位固定装置に動物を配置。 2％、モニターの麻酔にイソフルラン濃度を下げてください。大型動物（> 300グラム）はイソフルランの濃度が高いが必要な場合があります。麻酔は手術中に監視し、イソフルラン投与量は適宜調整する必要があります。呼吸の深さと速度は、常に評価されなければならない、と深い苦痛の欠如のためのつま先のピンチの評価は（5分ごとに）実行する必要があります。
3. 手術が完了したら、イソフルランをオフにすると定位装置から取り外す前に数分間、息の酸素に動物を可能にする。体温は、手術の毛布及び/または手術中に規制加熱毛布を使用してある動物をカバーすることによって維持されるべきである。

3。眼内注射用の注射器の準備

1. 最初に、眼内注射を行うための注射器システムを組み立てます。 10μLRNガス密閉1701ハミルトンのシリンジは、注入に使用されます。注射器の端上の任意​​の針またはRNナットの存在を取り外します。
2. 圧縮継手のフェルールPEEKカップにPFAフェルールを挿入します。その後、注射器の端に完全なフィッティングを挿入し、ゆるく上からRNのナットをねじ込みます。
3. RNナットの開口部を通して、圧縮フィッティングに1 / 16インチPEEKチューブの一端を挿入します。 PEEKチューブが完全に装着されていることを確認します。 PEEKチューブをシール、フェルールを圧縮するためにRNのナットを締めます。
4. デュアルRNガラスカプラーの両端にステップ3.2を実行してください。 RNのナットを締めて、デュアルRNガラスカプラーの一端にPEEKチューブの自由端を取り付けます。
5. プルガラスのマイクロピペットは、噴射システムのための針とバレルを形成します。ガラスピペットを作製し、デュアルRNガラスカプラーの自由端にガラスピペットを挿入するために1.5 mm外径肉厚ガラスキャピラリーチューブを使用してください。場所にピペットを修正するためにRNのナットを締めます。
6. プルガラスのマイクロピペットの先端の細い眼内注射を行うために一般的には小さすぎます。適切な直径の先端を作成するために、手術用顕微鏡を使用して、視覚的な指導の下でガラスピペットの先端を破る。ガラス標本スライドのつや消しの終わりは、よくピペットを分解するのに適しています。角度でピペットを保持し、ブレークを作成するには、ガラスのフロスティングに沿って先端をこする。理想的には、最後の先端は少し斜めしてください。それは良いヒントを生成するためにいくつかの試みがかかる場合がありますので、使用前に複数のピペットを引く。
7. インジェクションシステムは油圧式です。そのため、注射器、PEEKチューブのリンカ、デュアルRNガラスのカプラーとガラスのマイクロピペットは、使用前にミネラルオイルで満たされている必要があります。ハミルトンシリンジ株式会社（PRMKIT）からプライミングキットを使用して、ミネラルオイルでプライミングの注射器を埋める。粘性油の簡単な通過を可能にする大径の針を使用してください。 10μLハミルトンのシリンジの注射筒内に収まるハミルトン90030針で針を交換してください。次に、鉱物油を注入しながらシールを提供するために、ハミルトン90030針を介してゴム隔膜を置きます。
8. 噴射システムの10μLハミルトンシリンジのバレルの後部にプライミング注射器のハミルトン90030針を挿入します。シールを作成するために注射器の端にしっかりとセプタムを押してください。
9. ゆっくりプランジャーを押し下げる。あなたは、インジェクションシステムのガラス素子を通して、鉱物油のパスを参照してください、と最後にガラスピペットに充填される。管に沿って気泡を除去するために、射出システムを介してオイルのすべてをプッシュする。充填シリンジは鉱物油が不足している場合、常に空気の気泡の形成を防ぐためにオイルを塗布しながら、ゆっくりと針を撤回。リフィルプライミング注射をし、再度注入。
10. 全体システムは無料のミネラルオイルと泡で満たされている場合、10μLハミルトンシリンジのオリジナルプランジャーを挿入します。システムから追加のミネラルオイルを除去するために、その旅の終わりまで、プランジャーを押し下げ。ガラスマイクロピペットクリーンと70％エタノールで清潔なシリンジの端を拭きます。
11. Withdraワットバレルの2μLマークにシリンジのプランジャー。ガラスのマイクロピペットの最後には空気が鉱油と注入されるように、目的の流体の間に緩衝地帯を提供することで入力されます。ピペットのバレルは、現在必要なソリューションにマイクロピペットの先端を配置し、ハミルトンシリンジのプランジャーを取り出すことにより埋めることができます。成体ラットの目にソリューションの以上4から5μLを注入しないでください。

4。眼内注射の方法：グローバル網膜を対象に

1. 定位フレーム（セクション2で説明したように）で麻酔し、安全な動物で、Alcaineの目が局所的に角膜を麻酔に低下します。あなたの指と場所角膜の表面に麻酔液の1滴でまぶたを開きます。
2. 硝子体腔内にガラスピペットを挿入し、必要なソリューションを提供シリンジにプランジャーを押し下げるためにピペットの位置、および別のを維持するためにいずれかの注射は、2人が必要です。
3. 手術用顕微鏡、グリップガラスマイクロピペットと指でデュアルRNガラスカプラーの下に。注射部位の反対側の"V"の形を形成し、もう一方の手の指でまぶたを広げ。まぶたにトラクションを適用することにより、眼は角膜輪部の背後にある後面を露出させる、軌道から昇格されます。注射部位の反対側の指で"V"形状を作成することによって、クレードルは、注入時の安定性を提供する目のために形成される。
4. ゆっくりと下向きの角度で、強膜を通して血管を欠い領域で、結膜を通してガラスのマイクロピペットの先端を挿入し、。ピペットは、強膜を貫通するときには、小さな"ポップ"を感じてください。やや下向きの角度でピペットを挿入すると針を挿入するときにレンズを打つ可能性が少なくなります。
5. 注射器を持っている人は今シリンジで2μLのマークにプランジャーを押すことによって溶液4μLを注入してください。注射は合計で約1〜2秒かかります。非常に遅い速度で注入することは> 3秒硝子体腔を通じて、ソリューションの初期拡散を低減します。あなたは、それによって手続きの成功を検証する、顕微鏡下で硝子体腔を通じてフラッシング注入溶液を見ることができます。
6. 約5秒間安定したマイクロピペットを保持し、針が挿入されたと同じ方向に、撤回。結膜が強膜穿刺を密封するために助け、小さな開口部にバックフラップになります。
7. リカバリ中に角膜の乾燥を防ぐため、および回復のケージに動物を戻すために、眼科の眼軟膏（涙ナトゥPM）で角膜の表面を覆う。
8. 手術後の鎮痛薬は、動物のケアの当局のガイドラインにしたがって投与されるべきである、と動物は、慎重に手術後に監視する必要があります。

5。選択的に視神経の断端から網膜神経節細胞を標的

1. 軸索切断に続く、視神経の切り株にトレーサー、薬物、プラスミド、siRNAまたはウイルスベクターを適用し、直接逆行性輸送を介して網膜神経節細胞をターゲットとしています。これは、最初の"視神経切断プロトコル^"22によると視神経切断を行うことによって実現されます。
2. 視神経にgelfoamを使用して、または直接注入の2つは、この手順を達成する主な方法があります。
3. gelfoamメソッドがトレース逆行に似ていますが、視神経で実験的な治療を配信するときには、軸索切断前上丘1週間に逆行トレーサーを注入することにより、網膜神経節細胞に事前にラベルすることが望ましいです。これは、一部のインスタンスで神経トレーサー実験物質またはその逆の逆行輸送を妨げることができる、ため、セルのトレースのために重要です。
4. 視神経が切断された直後に、実験的な溶液に浸漬gelfoamの小片はtransected視神経の切り株の上に配置されています。軌道の内容は、以前の場所に戻されます。目は、それが視神経の端の上に保つこと、それが軌道にgelfoamの部分をプッシュダウンする鉗子を使用する必要が中立位置に戻されます。
5. 注入法は、逆行性軸索流によって輸送されるためには軸索の細胞質へのアクセスを得る必要がある物質を送達するためのより効果的です。これは、siRNAとプラスミド、及び場合によってはウイルスベクターが含まれています。 5〜10μlのハミルトンシリンジはtransected視神経に必要なソリューションをインジェクトするために使用されます。
6. ファインチップデュモン鉗子による視神経のエッジグリップ。ベベルが表示されなくなるまで、平行神経で、視神経に針の先端を挿入。挿入された針は神経によってすべての側面に包まれる。短いベベルと針が望ましい。
7. nを一度eedleが神経に挿入され、穏やかに先端の細いピンセットで神経の両側をつまんで注射器4分の1回転を時計回りまたは反時計回りに回転させながら、ソリューションの4分の1を注入する。
8. あなたが針の完全な回転を完成し、注射器の内容全体を注入するまで、ステップ5.7を繰り返し続ける。最良の結果を得るためには気密10μLハミルトンシリンジを用いて溶液10μLの合計を注入する。
9. 神経からシリンジの先端を削除します。これは軸索の末端による取り込みのための追加のプールを形成するように軌道内神経から還流している余分な注入液を残す。
10. 彼らの元の位置に軌道の内容を返す、傷口を閉じ、そして動物が回復することができます。
11. 手術後の鎮痛薬は、動物のケアの当局のガイドラインにしたがって投与されるべきである、と動物は、慎重に手術後に監視する必要があります。

6。代表的な結果：

眼内注射は、世界的に網膜内のすべてのセルを対象とし、神経節細胞が硝子体腔に隣接する網膜の最も内側の神経層、に置かれているので、負傷RGCsに配信物質のためによく働く。 RGCsも直接transected視神経の切り株に物質を提供することで、ターゲットとすることができます。 Fluorogold逆行標識されたRGCsは、図1に示すように、神経切り株からペプチド、薬物、ベクター、プラスミド、またはsiRNAを用いてターゲットとすることができます。図1A - Cは、上丘にFluorogoldを注入することによって事前に標識されたRGCsのsomaの複数形でCy3標識ペプチドの局在を示しています。 Cy3で標識されたペプチドは、すぐに軸索切断後の視神経に注入され、そして網膜は、固定時の組織の外浸出からペプチドを防ぐために生きて画像化した。図1D - Fは、Cy​​3標識siRNAとaxotomized RGCsでFluorogold逆行性トレーサーの局在を示しています。 Cy3標識siRNAはすぐに軸索切断後の視神経の切り株に注入し、網膜が生きて画像化した。

図1。視神経の切り株に標識されたペプチドまたはsiRNAのどちらかの軸索切断と注射後1日でflatmounted網膜におけるRGCsの落射蛍光顕微鏡写真。標識ペプチドの逆行性輸送、視神経への軸索切断し、ペプチド注入1日後に続くRGCsでaxotomized RGCsの（）Fluorogold逆行性標識法1日のpostaxotomyで（B）Cy3蛍光。の（C）オーバーレイ（A）と（B）Fluorogoldラベル付けRGCsでCy3標識ペプチドの選択的局在を証明しています。 （DF）Fluorogoldラベル付けRGCs（D）の細胞体はまた、オーバーレイ（F）に示すように24時間以前の視神経の切り株に注入Cy3標識siRNAは（E）で充填される。 AC中のスケールバーは50μmである。 DFでのスケールバーは20μmである。

Discussion

視神経切断は、成体中枢神経系ニューロンのアポトーシスの高度に再現可能なモデルです。この原稿で実証実験操作は、損傷後のRGCアポトーシスのメカニズムの研究を可能にする。

眼内注射は、網膜の全世界をターゲットするのに便利です。それはガラスピペットの先端にレンズを傷つけないよう重要であるとして、この手順では、いくつかの練習が必要です。レンズの損傷は、細胞の生存と再生^20、21を変えること、増殖因子の放出を引き起こすことが示されている。それは先端の方向に平行なガラスピペットを慎重に挿入し、撤回することも重要です。ガラスピペットの先端上の任意​​の横力は、レンズや網膜の損傷を硝子体腔を入力するようにガラスの断片を引き起こす可能性があります。あまりにも細かいです先端にピペットを使用すると、粘性解の配信を許可することはできません。強膜が誤ってレンズをパンクチャリングの機会を増やす穿刺時にまた、非常に微細な先端は、触覚フィードバックを与えるものではありません。顕微鏡下で観察するとレンズは、どの穿刺マークから明らかと無料のままにしてください。レンズが破損している場合は、白内障がしばしば形成されるとレンズが曇るし、これらの実験結果を除外する必要があります。

管に沿って現在に気泡がない場合にシリンジシステムが最適に動作します。空気が膨張し、解決策の撤回または配信の応答性を減少させる圧縮することができます。空気の泡が表示されている場合、プライミングのシリンジと鉱物油とそれらを洗い流す。コンプレッションフィッティング付きデュアルRNガラスアダプタは、異なる動物、治療法、または破損した場合の間の効率的なピペットを変更することができます。このシステムは、堅牢で、フェルールは限りピペットを慎重に挿入されると、交換する必要がある前に何年も続く。

直接視神経を注入することによりRGCsを標的とするいくつかの注意点と、かなり簡単な手順です。視神経の断端が短すぎると、それは注射が困難になります。短い切り株はまた、それはベベルのレベルに挿入される針が視神経乳頭の近くに網膜血管を損傷する可能性が高まります。この手法で神経の注射を行う際にこのように、長さが約2mmの視神経の断端が望ましい。注射は、注射器のベベルが完全に視神経で囲まれている場合に最適です。ケアは、これは流体がそれによって注射の有効性を減少させる注射部位を終了できるように、低抵抗の領域を作成すると神経の側から針の先端を通過しないように注意する必要があります。

このようなウイルス粒子または形質転換細胞のような潜在的なバイオハザードを操作するとき、それは制度的なガイドラインと安全手順に従うことが重要です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.
Rat Gas Mask	Stoelting Co.
Anesthesia System	VetEquip	901806
Isoflurane (PrAErrane)	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
Surgical Microscope	WPI, Zeiss, Leica
Alcaine Eye Drops	Alcon
Tears Naturale P.M.	Alcon
Fine tip Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-00
10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2)	Hamilton Co	80030
1/16 inch Compression Fittings	Hamilton Co	55751-01
1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing	Supelco, Sigma-Aldrich	Z226661
Dual RN Glass Coupler	Hamilton Co	55752-01
Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa	Hamilton Co	PRMKIT