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Summary
시신경의 절개면은 성인 CNS 손상의 널리 사용되는 모델입니다. 이 모델은 전 세계적으로 망막을 대상에 직접 망막 신경절 세포의 부상의 연결 인구를 대상으로 실험 조작의 번호를 수행하는 데 이상적입니다.
Abstract
망막 신경절 세포 (RGCs)는 CNS의 뉴런되는 시신경을 통해 뇌로 망막의 출력 영상 정보. 시신경은 안구의 궤도 내에서 액세스하고 완전히 전체 인구의 RGC axons를 절단 (axotomized) 그었 수 있습니다. 시신경의 절개면은 성인 CNS 1-4에서 apoptotic 세포의 연결을 죽음의 재현성 모델입니다. 눈 유리체 챔버가 intraocular 주사를 통해 실험 조작을 허용, 망막에 약물 전달 캡슐 역할을하기 때문에이 모델은 특히 매력적입니다. 유리 체액을 통해 화학 물질의 확산들은 전체 인구 RGC에 따라 행동을 보장합니다. 바이러스성 벡터, plasmids 또는 짧은 방해 RNAS는 (siRNAs)도 5-12를 망막 세포를 감염 또는 transfect하기 위해 유리 챔버로 전달하실 수 있습니다. Adeno - 관련 바이러스 (AAV) 벡터의 높은 tropism은 주사 사이트 6, 7, 13-15 가까운 세포의 90 %를 접근 감염 속도와 대상 RGCs에 유용합니다. 또한, RGCs은 선택적으로 그들의 목표 우수한 colliculus 10으로 시신경 16-19 또는 주입 벡터의 컷 끝까지 siRNAs, plasmids, 또는 바이러스성 벡터를 적용하여 transfected 수 있습니다. 이것은 연구자들이 다른 방관자의 뉴런이나 주변 glia에 혼란함을 주죠 효과없이 부상의 연결 인구 apoptotic 메커니즘을 공부하실 수 있습니다. RGC apoptosis는 세포 죽음은 세포가 빠르게 타락한 이후 3~4일의 postaxotomy을 지연 의하여 시간 코스 특성이 있습니다. 이것은 apoptosis에 관련된 경로에 대한 이동 실험 조작에 창을 제공합니다. 직접 가로 시신경 스텀프에서 RGCs를 대상으로 노는 즉시 신경을 절단 후, axotomy의 시간에 수행됩니다. 대조적으로, 물질 intraocular 경로를 통해 전달하는 경우, 그들은 axotomized RGCs에서 apoptosis의 개시를 이전, 이전에 수술이나 수술 후 첫 3 일 이내에 주입 수 있습니다. 현재 기사에서 우리는 시신경의 절개 후 실험 조작을위한 여러 가지 방법을 보여줍니다.
Protocol
1. 외과 기술
- 실험 무균 기술을 사용하여 특정 기관의 동물 사용 프로토콜에 따라 수행하여야한다. 살아있는 조직과 접촉으로 오는 악기와 자료 (솔루션, 시험 물질, 추적기, 바늘 등) 동물 복지 및 연구에 대한 잠재적인 부정적 영향에 감염하고 불리한 영향을 방지하기 위해 멸균해야합니다.
2. 마취
- 쥐 한 동물 isoflurane 기화기 시스템을 사용 anaesthetized 것입니다. 0.8 L / isoflurane 가스를 기화하는 분의 비율로 의료 학년 산소를 사용하십시오. 첨부된 마취 상자에 동물을 배치하고 호흡이 둔화하고 있으며 동물이 진정 될때까지 4퍼센트의 isoflurane 농도에 전화.
- 다음, stereotaxic 프레임 가스 마스크 첨부 파일에 가스 흐름을 스위치와 stereotaxic 장치에 동물을 놓으십시오. 2 % isoflurane 농도를 켜고 마취를 모니터링합니다. 큰 동물 (> 300g)는 isoflurane의 높은 농도를 필요로 할 수 있습니다. 마취는 수술 중에 모니터링하고 isoflurane 복용량이 적절하게 조정해야합니다. 깊이와 호흡 속도는 지속적으로 평가해야하고, 깊은 고통의 부재에 대한 발가락 핀치 평가 (매 5 분)을 수행하여야한다.
- 수술이 완료되면, isoflurane을 해제하고 stereotaxic 장치에서 제거하기 전에 몇 분 동안 호흡 산소에 동물을 허용합니다. 체온은 수술 담요 및 / 동물을 포함하거나 수술하는 동안 규제 난방 담요를 사용하여 유지 관리해야합니다.
3. Intraocular 주입을위한 주사 준비
- 첫째, intraocular 주사를 수행하는 주사기 시스템을 조립. 10 μL RN Gastight 1,701 해밀턴 주사기 주입에 사용됩니다. 주사기의 끝부분에있는 모든 바늘이나 RN 너트 선물을 제거합니다.
- 압축 피팅 물미 피크 컵에 PFA 물미를 삽입합니다. 그런 다음 주사기의 끝부분에 완벽한 피팅을 삽입하고 느슨하게 맨 위로 RN 너트를 나사.
- RN 너트의 구멍을 통해 압축 피팅에 16분의 1 인치 피크 튜브의 한쪽 끝을 넣습니다. 피크 튜브가 완전히 장착되어 있는지 확인하십시오. 피크 튜브를 밀봉, 물미을 압축 RN 너트를 조이십시오.
- 듀얼 RN 유리 커플러의 양쪽에 3.2 단계 수행합니다. RN 너트를 강화하여 이중 RN 유리 커플러의 한쪽 끝을 위해 피크 튜브의 자유로운 끝을 연결합니다.
- 가져온 유리 micropipette는 분사 시스템의 바늘과 총구를 형성합니다. 유리 pipettes를 조작 1.5 mm OD 두께 벽으로 둘러싸인 유리 모세관 튜브를 사용하여 듀얼 RN 유리 커플러의 자유로운 끝에 유리 피펫을 삽입합니다. 장소에 피펫을 수정하기 위해 RN 너트를 조이십시오.
- 가져온 유리 micropipettes의 벌금 끝이 intraocular 주사를 수행하기위한 일반적으로 너무 작습니다. 적절한 직경의 팁을를 생성하기 위해, 수술 현미경을 사용하여 시각적인지도 아래 유리 피펫의 팁을 휴식. 유리 슬라이드 표본의 프로스트 엔드 잘 피펫을 깰 적합합니다. 각도에서 피펫 잡고 휴식을 만들기 위해 유리 설탕을 입힘 따라 팁을 문지 르세요. 이상적으로, 최종 팁 약간 bevelled해야합니다. 좋은 팁을 생산하기 위해 몇 가지 시도 걸릴 수 있으므로 사용하기 전에 여러 pipettes를 가져옵니다.
- 분사 시스템은 유압합니다. 따라서, 주사기, 피크 튜브의 링커, 듀얼 RN 유리 커플러와 유리 micropipette는 사용하기 전에 미네랄 오일로 가득해야합니다. 해밀턴 주사기 (주) (PRMKIT)에서 마중물 키트를 사용하여, 미네랄 오일 마중물 주사기를 입력하십시오. 점성 오일 쉽게 통과를 허용하는 큰 직경의 바늘을 사용합니다. 10 μL 해밀턴 주사기의 총신 내부 맞는 해밀턴 90,030 바늘로 바늘을 교체합니다. 다음, 미네랄 오일을 주입하면서 인감을 제공하기 위해, 해밀턴 90,030 바늘을 통해 고무 심장을 넣으십시오.
- 분사 시스템의 10 μL 해밀턴 주사기의 통의 후면에 마중물 주사기의 해밀턴 90,030 바늘을 삽입합니다. 도장을 만들 수있는 주사기의 끝을 단단히 대한 심장을 누르십시오.
- 천천히 플런저를 우울. 당신은 분사 시스템의 유리 요소를 통해 미네랄 오일 패스를보고, 마지막으로 유리 피펫을 작성합니다. 넓이 함께하는 기포를 제거하기 위해 분사 시스템을 통해 오일을 모두 밀어. 충전 주사기는 광유에서 실행하고있는 경우 지속적으로 공기 방울 형성을 방지하기 위해 기름을 분배하면서 천천히 바늘을 철회. 리필 마중물 주사기를 다시 주입.
- 전체 시스템을 무료로 미네랄 오일과 거품으로 가득되면 10 μL 해밀턴 주사기의 원래 플런저를 삽입합니다. 시스템에서 추가적인 미네랄 오일을 제거하기 위해서는 여행이 끝날 때까지 플런저를 우울하게. 유리 micropipette 깨끗하고 70 % 에탄올로 세척 주사기의 끝을 닦아주십시오.
- Withdraw 배럴에서 2 μL 표시 주사기의 플런저. 유리 micropipette의 끝 공기가 미네랄 오일 주입으로 원하는 유체 사이의 버퍼 영역을 제공하는 작성합니다. 피펫 바렐 이제 원하는 솔루션에 micropipette의 끝에 배치하고 해밀턴 주사기의 플런저를 철수 통해서하실 수 있습니다. 성인 쥐 안구에 솔루션 이상의 4-5 μL를 주입하지 마십시오.
4. Intraocular 사출 절차 : 전세계 망막 타겟팅
- anesthetized과 stereotaxic 프레임 (로 제 2의 설명에)에서 보안 동물, Alcaine 아이가 몸에 붙이기도 각막을 마취하는 방울 사용합니다. 손가락과 장소 각막의 표면에 마취 솔루션 중 하나를 드롭으로 눈꺼풀을 엽니다.
- 하나는 유리체 챔버에 유리 피펫을 삽입하고 피펫 위치를 유지하고, 또 원하는 솔루션을 제공 주사기의 플런저를 우울하게하는하기 : 사출은 두 사람이 필요합니다.
- 수술 현미경, 그립 유리 micropipette과 손가락으로 듀얼 RN 유리 커플러에서. 사출 사이트의 맞은편에 "V"모양을 형성, 무료 손의 손가락으로 눈꺼풀을 전파. 눈꺼풀에 견인을 적용하여, 눈은 limbus 뒤에 사후 표면을 노출, 궤도 밖으로 상승됩니다. 사출 사이트 반대편 손가락으로 'V'모양을 만들어, 크래들은 주입했을 때 눈이 안정성을 제공 형성됩니다.
- 부드럽게 하향 각도에서 공막엔을 통해 혈관이없는 상태 영역에서 결막을 통해 유리 micropipette의 끝부분을 삽입합니다. 피펫은 공막엔을 침투하면 작은 '팝업'을 생각해야합니다. 약간 아래쪽 각도에서 피펫을 삽입하면 바늘을 삽입시 렌즈를 누르 기회를 줄일 수 있습니다.
- 주사기를 들고있는 사람은 이제 주사기에 2 μL 표시 플런저를 우울하여 솔루션의 4 μL를 주입해야합니다. 주사 총 약 저에게 초 정도 소요됩니다. 아주 느린 속도로 주입하는 것은> 3 초 유리 챔버를 통해 솔루션의 초기 확산을 줄일 수 있습니다. 당신함으로써 절차의 성공을 확인, 현미경으로 유리체 챔버를 통해 플러싱 주입 솔루션을 볼 수 있습니다.
- 약 5 초 동안 꾸준한 micropipette을 보유하고 바늘을 삽입했습니다 같은 방향으로, 철회. 결막은 scleral 소중히 밀봉하는 데 도움이 작은 오프닝을 통해 다시 펄럭 것입니다.
- 복구하는 동안 각막 건조를 방지하고 복구 케이지에 동물을 반환하기 위해 안과 눈 연고 (눈물 Naturale PM)로 각막의 표면을 커버.
- 포스트 - 수술 진통제는 동물 보호 기관의 지침에 따라 관리되어야하고, 동물은 신중하게 수술 후 모니터링해야합니다.
5. 선택 시신경 스텀프에서 망막 신경절 세포를 타겟팅
- , 시신경 스텀프에 추적기, 약물, plasmids, siRNAs 또는 바이러스성 벡터를 적용 axotomy에 따라 직접 역행 수송을 통해 망막 신경절 세포를 대상으로합니다. 이것은 처음 "시신경의 절개 프로토콜"22에 따라 시신경의 절개를 수행하여 수행됩니다.
- 시신경에 gelfoam을 이용하거나, 직접 분사 두이 절차를 수행하는 주요 방법이 있습니다.
- 그것이 이전 axotomy에 우수한 colliculus 일주에 역행 추적기를 주사하여 사전 라벨 망막 신경절 세포에 바람직 시신경에서 실험적 치료를 제공하지만 때 gelfoam 방법은, 추적 역행하는 것과 비슷합니다. 이것은 어떤 경우에의 연결을 추적하는이 실험 물질 또는 그 반대의 역행 전송을 방해할 수 있기 때문에 세포 추적하는 것이 중요합니다.
- 시신경이 절단 직후, 실험 용액에 담가 gelfoam의 작은 조각은 가로로 시신경 스텀프 이상 배치됩니다. 궤도 내용은 다음 자신의 이전 위치로 반환됩니다. 눈은 그것은 시신경의 끝에 이상 남아 있도록, 궤도 속으로 gelfoam의 조각을 밀어 집게를 사용하는 데 필요한 중립 위치로 반환하는 경우.
- 사출 기술은 retrogradely axoplasmic 흐름에 의해 운반되기 위해서는 축삭의 세포질에 액세스할 수 있어야합니다 물질의 전달에 대한 더 효과적입니다. 이것은 siRNAs와 plasmids, 일부 경우에 바이러스 벡터를 포함합니다. 50-10 μL 해밀턴 주사기는 가로로 시신경에 원하는 솔루션을 주입하는 데 사용됩니다.
- 좋은 팁 더몬트 포셉과 시신경의 가장자리 그립. 베벨은 더 이상 표시되지 않습니다 때까지 병렬 신경으로 시신경에 바늘의 끝을 삽입합니다. 삽입된 바늘은 신경에 의해 사방에 쌌다는 것입니다. 짧은 베벨과 바늘이 바람직합니다.
- N되면eedle가 신경에 삽입, 부드럽게 잘 팁 포셉과 신경의 측면을 당기 주사기 사분의 일의 차례가 시계 방향 또는 시계 반대 방향으로 회전하면서 솔루션 중 하나 분기 주입.
- 당신이 바늘의 전체 회전을 완료하고 주사기의 전체 내용을 주입 때까지 단계 5.7을 반복 계속합니다. 최상의 결과를 얻으려면 gastight 10 μL 해밀턴 주사기를 사용하여 솔루션을 10 μL의 총 주입.
- 신경에서 주사기의 끝부분을 제거합니다. 이 axons의 끝을하여 이해를위한 추가적인 수영장을 형성하므로 궤도 내의 신경에서 refluxed 가지고있는 여분의 주입 유체를 남겨주세요.
- 원래 위치로 궤도 내용을 반환, 상처를 닫고, 그리고 동물이 복구 수 있습니다.
- 포스트 - 수술 진통제는 동물 보호 기관의 지침에 따라 관리되어야하고, 동물은 신중하게 수술 후 모니터링해야합니다.
6. 대표 결과 :
Intraocular 주사는 세계 망막의 모든 세포를 대상으로하고, 신경절 세포가 유리 챔버에 인접한 망막의 내면의 연결 계층에 위치하고 있기 때문에 부상 RGCs에게 전달 물질에 대해 잘 작동합니다. RGCs도 직접 가로 시신경 스텀프에 물질을 전달하여 타겟팅할 수 있습니다. Fluorogold retrogradely 표시 RGCs는 그림 1에서 그림과 같이 신경 그루터기에서 펩티드, 약물, 벡터, plasmids, 또는 siRNAs를 사용하여 타겟팅할 수 있습니다. 그림 1A - C는 우수한 colliculus로 Fluorogold 주사에 의해 사전 라벨이 붙지만 RGCs의 somata에 Cy3 레이블 펩타이드의 지방화를 보여줍니다. Cy3 분류 펩티드는 즉시 axotomy 후 시신경로 주입되었고, 망막은 고정 기간 동안 조직의 밖으로 침출에서 펩티드를 방지하기 위해 살아있는 몇 군데했다. 그림 1D - F는 Cy3 표시 siRNAs와 axotomized RGCs에 Fluorogold 역행 추적의 지방화를 보여줍니다. Cy3 표시 siRNAs은 즉시 axotomy 후 시신경 스텀프에 주입되었고, 망막이 살아있는 몇 군데했습니다.
그림 1. 시신경 스텀프로 분류 펩티드 또는 siRNAs 중 하나 axotomy 및 주사 후 1 일 flatmounted 망막에 RGCs의 Epifluorescence micrographs. (A) Fluorogold 역행 1 일 postaxotomy에서 axotomized RGCs의 라벨 (B) 표시 펩티드의 역행 교통, 시신경에 axotomy 및 펩타이드 주사 후 일일 다음 RGCs에 Cy3 형광. 의 (C) 중첩 (A)와 (B) Fluorogold 표시 RGCs에 Cy3 레이블 펩티드의 선택 지방화를 시연. (DF) Fluorogold 표시 RGCs (D)의 세포 기관은 또한 오버레이 (F)로 표시 24시간 이전 시신경 스텀프에 주입 Cy3 레이블 siRNAs (E), 가득합니다. AC의 스케일 바에는 50 μm의 수 있습니다. DF의 스케일 바는 20 μm의 수 있습니다.
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Discussion
시신경의 절개면은 성인 CNS의 신경 세포의 apoptosis의 높은 재현성 모델입니다. 이 원고에서 보여준 실험 조작은 부상 후 RGC apoptosis의 메커니즘 연구를 허용합니다.
Intraocular 주사는 망막의 전세계를 타겟하는 데 유용합니다. 그것이 유리 피펫의 끝에있는 렌즈를 다치게하지 않는 것이 중요합니다 같은이 절차는 연습이 필요합니다. 렌즈 손상은 세포 생존과 재생 20, 21을 변경, 성장 요인의 출시를 일으키는 것으로 표시되었습니다. 신중하게 삽입 및 팁의 방향에 유리 피펫의 병렬를 철회하는 것도 중요하다. 유리 피펫의 끝에 모든 측면 힘이 렌즈 또는 망막 손상을 유리체 챔버를 입력 유리 조각을 일으킬 수 있습니다. 너무 괜찮 팁있는 피펫을 사용하면 점성 솔루션의 배달을 허용하지 않을 수 있습니다. 공막엔 실수로 렌즈를 펑쳐링의 기회를 증가 구멍을 때 또한 매우 훌륭한 조언 촉각 피드백을 제공하지 않습니다. 현미경으로 관찰하면 렌즈는 바늘 자국을 명확하고 무료로 유지됩니다. 렌즈가 손상된 경우, 백내장은 종종 양식되고 렌즈를 통해 구름이되며, 이러한 실험 결과는 제외해야합니다.
넓이 따라 현재에는 기포가없는 경우 주사기 시스템은 최상의 상태로 작동합니다. 공기 확장 및 솔루션 탈퇴 또는 배달의 응답 속도를 감소 압축할 수 있습니다. 기포가 표시되는 경우, 마중물 주사기 및 광물 기름으로 그들을 밖으로 몰아내. 압축 피팅과 함께 듀얼 RN 유리 어댑터는 다른 동물, 트리 트먼트, 또는 파손의 경우 사이의 피펫가 효율적으로 변화합니다. 이 시스템은 강력한이고 ferrules가 한 pipettes은 신중하게 삽입으로 교체해야하기 전에 몇 년 지난 것이다.
직접 시신경을 주사하여 RGCs를 대상으로하는 것은 몇 가지주의 사항과 상당히 빠른 절차입니다. 시신경 스텀프이 너무 짧은 경우, 그것은 주사 어렵게 만듭니다. 짧은 그루터기 또한이 베벨의 수준에 삽입으로 바늘이 시신경 머리 근처에 망막 혈관을 손상시킬 수있는 가능성이 높아집니다. 이 기술을 신경 주사를 수행할 때 따라서, 길이 약 2mm의 시신경 스텀프이 바람직합니다. 주사는 주사기의 베벨 완전히 시신경 내에 동봉된 때 최고의 작품. 관리들은이 액체가함으로써 사출의 효과를 감소 사출 사이트를 종료할 수 있도록, 낮은 저항 영역을 만드는 등 신경의 측면을 통해 바늘 팁을 통과하지 않도록해야합니다.
이러한 바이러스성 입자 또는 변형 세포와 같은 잠재적인 생물 학적 작업을하면, 그것은 제도적 지침 및 안전 절차를 따라야하는 것이 중요합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
PDK는 CIHR 운영 그랜트 (청소 86,523)에 의해 지원됩니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic Frame | Stoelting Co. | ||
| Rat Gas Mask | Stoelting Co. | ||
| Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Isoflurane (PrAErrane) | Baxter Internationl Inc. | DIN 02225875 | |
| Surgical Microscope | WPI, Zeiss, Leica | ||
| Alcaine Eye Drops | Alcon | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | ||
| Fine tip Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| 10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2) | Hamilton Co | 80030 | |
| 1/16 inch Compression Fittings | Hamilton Co | 55751-01 | |
| 1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing | Supelco, Sigma-Aldrich | Z226661 | |
| Dual RN Glass Coupler | Hamilton Co | 55752-01 | |
| Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa | Hamilton Co | PRMKIT |
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신경 과학 제 51 중추 신경계 망막 신경절 세포 Axotomy 시신경의 절개 Intraocular 사출 신경 스텀프 Transfection 바이러스성 벡터 짧은 간섭 RNAErratum
Formal Correction: Erratum: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS
Posted by JoVE Editors on 05/31/2011.
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A correction was made to Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS. There was an error in the order of the authors. The authors ordering has been corrected to:
Philippe M. D'Onofrio, Mark M. Magharious, Paulo D. Koeberle
instead of:
Mark M. Magharious, Philippe M. D'Onofrio, Paulo D. Koeberle
