Summary
Associazioni di genetica spesso rimangono inspiegabili a livello funzionale. Questo metodo si propone di valutare l'effetto del fenotipo-marcatori genetici associati sull'espressione genica analizzando cellule eterozigoti per SNP trascritte. La tecnologia permette la misura precisa di MALDI-TOF spettrometria di massa per quantificare allele-specifici prodotti primer extension.
Abstract
Il numero di importanti associazioni di genetica comune con tratti complessi è in costante aumento. Tuttavia, la maggior parte di queste associazioni non sono stati compresi a livello molecolare. Uno dei meccanismi che mediano l'effetto di varianti del DNA sui fenotipi è l'espressione genica, che ha dimostrato di essere particolarmente rilevante per i tratti complessi 1.
Questo metodo verifica in un contesto cellulare l'effetto di specifiche sequenze di DNA sull'espressione genica. Il principio è quello di misurare l'abbondanza relativa di trascrizioni derivanti dai due alleli di un gene, analizzando le cellule che portano una sola copia delle sequenze di DNA associate con la malattia (le varianti di rischio) 2,3. Pertanto, le cellule utilizzati per questo metodo dovrebbe rispondere a due requisiti fondamentali genotipica: devono essere eterozigote sia per le varianti del DNA e rischio di marcatori del DNA, polimorfismi di solito codifica, che possono distinguere trascrizioni base alla loro origine cromosomica (Figura 1). Varianti del DNA e rischio marcatori del DNA non c'è bisogno di avere la stessa frequenza degli alleli, ma la fase (haplotypic) rapporto di marcatori genetici ha bisogno di essere compreso. E 'anche importante scegliere i tipi di cellule che esprimono il gene di interesse. Questo protocollo fa esplicito riferimento alla procedura adottata per l'estrazione degli acidi nucleici da fibroblasti ma il metodo è ugualmente applicabile ad altri tipi di cellule, tra cui le cellule primarie.
DNA e RNA sono estratti dalle linee cellulari selezionate e cDNA viene generato. DNA e cDNA vengono analizzati con un test primer extension, creato per identificare i marcatori del DNA codificante 4. Il test primer extension viene effettuata utilizzando la (Sequenom) MassARRAY 5 piattaforma secondo le specifiche del produttore. Prodotti primer extension vengono poi analizzati da matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF/MS). Perché gli indicatori selezionati sono eterozigoti che genererà due picchi sui profili MS. L'area di ogni picco è proporzionale alla ricchezza trascrizione e può essere misurata con una funzione del software Typer MassARRAY per generare un rapporto allelica (allele 1: allele 2) calcolo. Il rapporto alleliche ottenute per cDNA è normalizzato con quello misurato dal DNA genomico, dove è atteso il rapporto allelica da 1:1 a correggere artefatti tecnici. Marcatori con un rapporto normalizzato alleliche significativamente diverso da 1 indicano che la quantità di trascrizione generato dai due cromosomi nella stessa cella è diversa, suggerendo che le varianti del DNA associate con il fenotipo hanno un effetto sull'espressione genica. Controlli sperimentali dovrebbe essere usato per confermare i risultati.
Protocol
1) Colture Cellulari
- Selezionare i tipi di cellule che esprimono il gene di interesse.
- Selezionare linee cellulari eterozigoti sia per le varianti di rischio e trascritto polimorfismo del DNA codifica all'interno del gene di interesse (Figura 1).
- Cultura le linee cellulari selezionate in base alle specifiche del fornitore e preparare 2 x 10 cm capsule di Petri per l'estrazione del DNA e RNA, rispettivamente.
- Quando le cellule raggiungono l'80% confluenza avviare la procedura per le cellule raccolti ed isolare il DNA e l'RNA sia seguendo la procedura descritta di seguito o con i kit disponibili in commercio.
2) Estrazione del DNA
- Rimuovere il supporto dal piatto, lavare con PBS e aggiungere al piatto 500 microlitri di una soluzione di lisi (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA e 50 mg / ml RNasi A).
- Roccia delicatamente la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Raschiare il lisato di cellule in una provetta ed incubare a 37 ° C durante la notte.
- Aggiungi proteinasi K alla concentrazione finale di 100 mg / ml ed incubare a 37 ° C durante la notte.
- Estrarre il DNA con un uguale volume di fenolo-cloroformio pH 8, ripeto, quindi estrarre con un uguale volume di cloroformio / alcool isoamilico.
- Precipitare il DNA con 1 / 10 ° volume 3 M di NaCl e 2,5 volumi di etanolo 100%.
- Lasciare in ghiaccio per 5 minuti e poi girare a 13.000 giri per 30 minuti a 4 ° C.
- Lavare il DNA con etanolo al 70%, permette di asciugare all'aria e risospendere in 200 ml di TE.
- Incubare a 65 ° C per 10 min e poi lasciare per 2 giorni a temperatura ambiente.
- Conservare a 4 ° C o lungo termine a -20 ° C.
3) estrazione RNA
- Rimuovere il supporto dal piatto, lavare con PBS, aggiungere 1 ml di TRIzol e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Raschiare le cellule, pipetta poche volte, trasferire in una provetta e incubare per 5 minuti.
- Spin per 10 min a 10.000 rpm a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta e aggiungere 200 ml di cloroformio.
- Agitare e spin per 10 min a 10.000 rpm a 4 ° C.
- Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e aggiungere un uguale volume di etanolo al 70%.
- Caricare la soluzione a 1 o 2 (a seconda del volume) colonna RNeasy e spin per 30 secondi alla massima velocità.
- Da qui seguire le istruzioni del kit RNeasy (Qiagen).
4) Nucleic Acid preparazione dei campioni
- Quantificare il DNA e la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop (Thermo Scientific).
- Preparare cDNA da 500-1000 ng di RNA utilizzando decamers casuale e SuperScript III della trascrittasi inversa (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore.
5) Estensione di analisi PCR e Primer
- Progettazione di due coppie di primers PCR per ogni marcatore del DNA, un paio per l'amplificazione del DNA genomico e l'altra coppia per l'amplificazione del DNA (Fig. 2). Luogo in avanti e indietro primer per l'amplificazione del DNA negli esoni diversi per evitare la contaminazione genomico. Progettazione primer per ottenere un prodotto di PCR nel range di 100-500 bp lunghezza.
- Preparare una reazione da 10 microlitri di PCR compresi 0,5 U Immolase Taq (Bioline) 0,8 mM dNTPs, 2 mM MgCl 2, 0,2 M ogni primer e 20 ng di entrambi i cDNA o DNA. Amplificare ogni campione in quattro reazioni indipendenti.
- Eseguire la reazione PCR nelle condizioni ottimizzate per ogni coppia di primer tenendo numero di ciclo in fase lineare di amplificazione.
- Togliere di PCR e dNTPs in eccesso tramite l'incubazione del prodotto di PCR con esonucleasi I e fosfatasi alcalina gamberetti (SAP) a 37 ° C per 20 minuti.
- Spot ogni prodotto di PCR due volte su una piastra da 384 pozzetti, in modo che 8 misure saranno disponibili per ogni campione.
- Progettare il fondo interno con il saggio Design (Sequenom) il software in modo che il fondo stesso può essere utilizzato per prodotti di PCR sia genomico e cDNA. Specificare la lunghezza fondo nel range di 14-18 bp e mescolare estensione anche combinazioni di 3ddNTPs (Fig. 2).
- Effettuare la reazione di estensione primer e analisi MALDI-TOF/MS utilizzando il sistema MassARRAY (Sequenom) secondo le istruzioni del produttore.
- Una tipica reazione di primer extension includono un passo a partire da 94 ° C per 2 minuti, seguita da 40 cicli di 94 ° C per 5 s, 52 ° C per 5 s e 72 ° C per 5 s.
- I prodotti fondo estensione vengono puliti con resina SpectroCLEAN e trasferiti su microarray (chip) da dispenser SpectroPOINT nanolitre.
- Gli oligonucleotidi estesi sono quantificati da MALDI-TOF SpectroREADER utilizzando uno spettrometro di massa.
6) Analisi Statistica
- Controllare i risultati MALDI-TOF/MS con il software Typer MassARRAY per la qualità generale di questo esperimento.
- Estratto della relazione Allelotyping che include i dati dell'area di picco.
- Per ogni singolo spettro calcolare ilrapporto tra l'area del picco di allele 1 e allele 2 (rapporto tra le aree di picco).
- Per ogni campione di cDNA derivare un picco media il rapporto tra area e deviazione standard, utilizzando la funzione corrispondente in Excel, attraverso il 8 misure.
- Ricavare la stessa media il rapporto tra area del picco in tutto l'8 per tranne del DNA genomico.
- Dividere il rapporto cDNA intendo per il rapporto genomica significa per valutare la deviazione per l'atteso rapporto 1:1.
7) Controlli sperimentali
- Per escludere artefatti sperimentali, ripetere l'esperimento, almeno tre volte.
- Quando possibile, i test per i marcatori del DNA di design aggiuntivi.
- Progettazione più coppie di primer PCR e primers estensione ricottura di fili sia in avanti che in retromarcia.
- Ogni volta che prova possibile in quanto negativo linee cellulari controlli che sono eterozigoti per i marcatori del DNA, ma non portano le varianti del DNA rischio associato al fenotipo (fig. 1 e fig. 3)
8) Risultati Rappresentante
Un esempio di allele-specifica analisi di espressione è mostrata in Figura 3 con esempi di tracce di spettrometria di massa. La figura mostra i risultati delle analisi di 4 prodotti fondo allele-specifica estensione effettuato su 4 diversi modelli. I grafici in alto rappresentano i risultati ottenuti dall'analisi del DNA genomico di due diverse linee cellulari, che sono entrambi eterozigoti per un polimorfismo trascritto codifica. Tuttavia, solo una linea cellulare è eterozigote per la variante del DNA di rischio (Figura 1). I grafici inferiori rappresentano i risultati ottenuti dall'analisi del cDNA generati dalle linee delle cellule stesse. Come risultato di artefatto sperimentale il primo picco è sempre superiore al secondo picco anche per l'analisi genomica. Pertanto, i risultati dall'analisi genomica sono utilizzati per normalizzare i dati cDNA. Dopo la normalizzazione, il rapporto allele è significativamente diverso da 1 nella linea cellulare A (dove il secondo picco appare più bassa rispetto alle altri spettri), mentre è molto vicino a 1 linea di cellule B. I dati suggeriscono che la linea cellulare A trasporta un variante del DNA, in fase con l'allele misurata dal secondo picco, che riduce l'espressione del gene in esame. Linea cellulare B offre un controllo molto comodo negativo.
Figura 1. Linea cellulare strategia di selezione. Linee cellulari A e B sono eterozigoti per un marker trascritto codifica (triangolo), ma solo una linea cellulare è eterozigote per la variante di rischio del DNA (cerchio). L'allele azzurro della variante di rischio è associato (o con un effetto diretto o perché in stretta correlazione con la variante attuale funzionale) con un livello inferiore di trascrizione.
Figura 2. Allele-specifici test primer extension. Questa figura mostrano il work-flow della procedura sperimentale effettuato per entrambi i DNA cDNA (a sinistra) e genomica (a destra) i modelli. Primer PCR (rettangoli grigi) sono progettati per amplificare un polimorfismo eterozigote codifica (triangolo). Per evitare la contaminazione genomica primer PCR temprare sequenze collocati in differenti esoni (luce barre blu) quando l'amplificazione è effettuata su modello di cDNA. Il prodotto PCR viene quindi utilizzato come modello per una reazione di primer extension realizzato con un primer di estensione, ricottura una base vicino al polimorfismo, e il mix appropriato di tre dideoxynucleotide (ddNTPs) terminatori (quadrati) e uno desossinucleotidi (cerchio) per estendere l'innesco di uno o due basi, rispettivamente. La risultante prodotti primer extension hanno masse diverse, che permettono la separazione e quantificazione mediante MALDI-TOF spettrometria di massa. La quantità di prodotto corrispondente alla allele azzurro del marcatore del DNA è relativamente più basso per l'allele rosso.
Figura 3. I risultati di un allele-specifici test di espressione. La figura mostrano i risultati di spettrometria di massa dall'analisi effettuata sul DNA genomico e cDNA di linea cellulare delle cellule A e linea B (Figura 1).
Discussion
Questo metodo consente di valutare l'effetto della malattia associata a varianti del DNA sull'espressione genica attraverso la valutazione in vivo allele-specifica differenza nel livello di trascrizione. In questo protocollo abbondanza relativa trascrizione si misura con MALDI-TOF, ma altre tecnologie consentono la quantificazione allele-specifici, come TaqMan 6,7, può essere utilizzato. Il limite maggiore di questo approccio è la disponibilità di marcatori trascritto codifica. Metodi basati sul principio descritto qui, ma approfittando di diverse classi di polimorfismi, sono stati descritti. Il test haploChip misure allele-specifica espressione utilizzando marcatori situati entro 1 kb di inizio della trascrizione o sito fine di un gene che sarebbe presente in una materia cromatina immunoprecipitato isolato con anticorpi specifici per l'RNA polimerasi II 8. In alternativa, SNPs intronico può essere utilizzato quando il modello viene eteronucleari RNA 9.
Il protocollo specifico qui descritto, in combinazione con il test haploChip, è stato utilizzato con successo per identificare un gene candidato per la dislessia (o difficoltà di lettura). Inizialmente uno studio di associazione genetica identificata una sequenza di DNA associata a dislessia e che si estendono su tre geni 10. L'allele-specifici test di espressione genica ha dimostrato che in presenza di dislessia, di DNA associati espressione varianti variazione è stata osservata solo per uno dei tre geni, ma non gli altri due 11.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust attraverso sovvenzioni a APM [076566/Z/05/Z], JCK [074318] e un premio di base per il Wellcome Trust Centre for Human Genetics [075491/Z/04].Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma-Aldrich | P-4417-100TAB | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| NaCl | VWR international | 27788.366 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| RNase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-500MG | |
| Phenol: chloroform | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Chloroform | VWR international | 100777C | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | |
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich | DNTP100A | |
| Exonuclease 1 | New England Biolabs | M0293S | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | |
| SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | |
| MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | |
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | |
| Equipment | |||
| Chilled microcentrifuge | Eppendorf | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | ||
| SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |
References
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