Summary
Genetik dernekler genellikle işlevsel bir düzeyde açıklanamayan kalır. Bu yöntem, analiz ederek transkripsiyonu SNP için heterozigot hücrelere gen ekspresyonu fenotipi ile ilişkili genetik belirteçlerin etkisini değerlendirmek amaçlamaktadır. Teknoloji allel spesifik astar uzatma ürünleri ölçmek için MALDI-TOF kütle spektrometresi doğru ölçüm sağlar.
Abstract
Ortak kompleks özellikleri ile önemli genetik derneklerin sayısı sürekli artmaktadır. Ancak, bu derneklerin çoğu moleküler düzeyde anlaşılmaktadır değil. Fenotipleri DNA varyantlarının etkisi aracılık mekanizmalardan biri, gen ekspresyonu, özellikle karmaşık özellikler için 1 ilgili olarak gösterilmiştir .
Bu yöntem, bir hücresel bağlamda gen ekspresyonu üzerine spesifik DNA dizilerinin etkisi testleri. Ilke, bir genin iki allel kaynaklanan hastalığı (risk çeşitleri) 2,3 ile ilişkili DNA dizilerinin bir kopyasını taşıyan hücrelerin analizi, transkript göreceli bolluk ölçmek için . Bu nedenle, bu yöntem için kullanılan hücreler, iki temel genotipik gereksinimleri karşılaması gerekir: DNA risk varyantları ve kromozom kökenli (Şekil 1) dayalı transkript ayırt edebilirsiniz DNA işaretleri, genellikle kodlama polimorfizmleri, iki heterozigot olmak zorunda. DNA risk varyantları ve DNA belirteçlerinin aynı allel sıklığı gerekmez ancak genetik belirteçlerin faz (haplotypic) ilişkinin anlaşılması gerekir. Ilgi gen ifade hücre tipleri seçmek için de önemlidir. Bu protokol, özellikle nükleik asitlerin fibroblastlar ayıklamak için kabul prosedürü ifade eder, ancak yöntemin birincil hücreler de dahil olmak üzere diğer hücrelere türleri için de geçerlidir.
DNA ve RNA hücre hatları elde ediliyor ve cDNA üretilir. DNA ve cDNA, kodlamayan DNA işaretleri 4 hedef için tasarlanmış bir astar uzantısı testi ile analiz edilir . Astar uzantısı tahlil üreticinin spesifikasyonlarına göre MassARRAY (Sequenom) 5 platformu kullanılarak yapılmaktadır. Primer uzatma ürünleri matriks yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon kütle spektrometresi (MALDI-TOF/MS) uçuş süresi ile analiz edilir. Seçilmiş belirteçlerinin heterozigot Çünkü iki tepe MS profilleri üretecektir. Her pik alanı transkript bolluk orantılıdır ve bir alel oranı (allel 1: 2 allel) oluşturmak için MassARRAY Typer yazılım bir fonksiyonu hesaplama ile ölçülebilir. CDNA elde allelik oranı genomik DNA, alel oranı 1:01 teknik eserler için doğru olması bekleniyor ölçülen kullanarak normalize. 1 önemli ölçüde farklı bir normalize allelik oranı ile belirteçleri fenotipi ile ilişkili DNA varyantları gen ekspresyonu üzerinde bir etkiye sahip olduğunu düşündüren, aynı hücrede iki kromozom elde edilen transkript miktarı farklı olduğunu göstermektedir. Deneysel kontrollerin sonuçları onaylamak için kullanılmalıdır.
Protocol
1) Hücre Kültürü
- Ilgi gen eksprese eden hücre türlerini seçin.
- DNA risk varyantları ve ilgi (Şekil 1) içinde gen transkripsiyonu kodlama polimorfizmi için heterozigot hücre hatları seçin.
- Kültür tedarikçi özellikleri ise DNA ve RNA ekstraksiyonu için 2 x 10 cm Petri yemekler hazırlamak göre seçilen hücre hatları.
- Hücrelerin% 80 izdiham aşağıda açıklanan prosedürü izleyerek ya da piyasada bulunan kitler kullanılarak hasat hücrelere prosedürünü başlatmak ve DNA ve RNA izole ulaştığınızda.
2) DNA Ekstraksiyon
- Çanak ortamları çıkarın, PBS ile yıkayın ve lizis solüsyonu (% 0.6 SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA ve 50 mg / ml RNaz A) çanak 500 mcL ekleyin.
- Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle hafifçe Rock plaka.
- ° C 37 gecede bir mikrosantrifüj tüp ve inkübe hücre lizat Pençe.
- Nihai konsantrasyonu 100 mg / ml proteinaz K ve 37 ° C gecede inkübe.
- Fenol-kloroform pH 8, tekrar eşit hacmi ile DNA ayıklayın, sonra kloroform / izoamil alkol eşit hacmi ile ayıklayın.
- 1 / 10 hacim 3 M NaCl ve 2,5 hacim% 100 etanol ile DNA çöktürün.
- 30 dakika 13.000 rpm'de dönmeye 4, sonra 5 dakika buz bekletin ve ° C
- DNA% 70 etanol ile yıkayın, hava kuru ve TE 200 mcL tekrar süspansiyon izin verir.
- 65 ° C'de 10 dakika ve oda sıcaklığında 2 gün bekletin.
- -20 ° C ya da uzun vadeli ° C 4 Mağaza
3) RNA Ekstraksiyon
- Çanak ortamları çıkarın, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe TRIzol ve 1 mL PBS ile yıkayın.
- Pençe hücreler, bir mikrosantrifüj tüp içinde bir kaç kez transfer, pipet ve 5 dakika inkübe edin.
- 10.000 rpm'de 10 dakika süreyle Spin 4 ° C
- Taze bir tüp içinde süpernatant transferi ve kloroform 200 mcL ekleyin.
- Shake ve 10.000 rpm'de 10 dakika için spin 4 ° C
- Taze bir tüp içinde sulu faz transfer ve% 70 etanol eşit hacmi ekleyin.
- 1 veya 2 (hacmine bağlı olarak) 30 saniye süreyle maksimum hızda RNeasy sütun ve spin çözüm yükleyin.
- Burada RNeasy kiti (Qiagen) talimatları takip edin.
4) Nükleik Asit Numune Hazırlama
- DNA ve RNA konsantrasyonu NanoDrop Spektrofotometre (Thermo Scientific) kullanarak sayısal olarak.
- Üreticinin talimatlarına göre rastgele decamers ve Üst Simge III Reverse Transcriptase (Invitrogen) kullanarak RNA 500-1000 ng cDNA hazırlayın.
5) PCR ve Primer Eklenti Testi
- Tasarım iki çift, her DNA markör için PCR primerleri, genomik DNA amplifikasyonu için bir çift ve cDNA için diğer çifti (Şekil 2 ). Ileri yerleştirin ve genomik kirlenmesini önlemek amacıyla farklı ekzonlarında cDNA astar ters. Tasarım aralığı 100-500 bp uzunluğunda bir PCR ürünü elde etmek için astar.
- 0.5 U Taq Immolase (BioLine) 0.8 mM dNTP, 2 mM MgCl 2, 0.2 M her astar ve cDNA veya DNA ya da 20 ng dahil olmak üzere 10 mcL PCR reaksiyonu hazırlayın. Dört bağımsız reaksiyonlar her numune artırın.
- PCR amplifikasyon doğrusal faz devir sayısı tutan her bir primer çifti için optimize edilmiş koşullar altında çalıştırın.
- Eksonükleaz ile PCR ürününün kuluçka fazla PCR primer ve dNTP çıkarın I ve 37 Karides Alkalin Fosfataz (SAP) ° C de 20 dakika.
- 384 plaka üzerine iki kez her bir PCR ürünü Spot, 8 ölçümleri, her bir örnek için uygun olacağını.
- Testi Tasarım (Sequenom) yazılımı ile aynı astar genomik ve cDNA PCR ürünleri için kullanılan böylece uzatma astar tasarlayın. 3ddNTPs kombinasyonları (Şekil 2) de dahil olmak üzere 14-18 bp ve uzatma karışımı astar süresini belirtin.
- Üreticinin talimatlarına göre MassARRAY sistemi (Sequenom) kullanarak astar uzatma reaksiyonu ve MALDI-TOF/MS analiz yürütmek.
- Tipik bir astar uzatma reaksiyonu bir başlangıç adımı 94 ° C, 2 dakika süreyle, 5 s, 5 s için 52 ° C ve 72 ° C 94 ° C 40 döngüleri takip 5 s.
- Astar uzatma ürünleri SpectroCLEAN reçine ile temizlenmeli ve SpectroPOINT nanolitre dağıtıcı tarafından mikroarray (chip) üzerine aktarılır.
- Uzun oligonükleotidler SpectroREADER bir kütle spektrometresi kullanarak MALDI-TOF nicel.
6) İstatistiksel Analiz
- MALDI-TOF/MS sonuçları deney genel kalitesi için MassARRAY Typer yazılımı ile kontrol edin.
- Pik alan verileri içeren Allelotyping raporu ayıklayın.
- Her bir spektrum hesaplamak içinallel 1 ve allel 2 (pik alanına oranı) pik alanı arasındaki oran.
- 8 ölçümleri arasında, Excel karşılık gelen fonksiyonunu kullanarak, her cDNA örnek için bir pik alan oranı ortalama ve standart sapma kaynaklanıyor.
- 8 ölçümleri genomik DNA boyunca aynı ortalama pik alan oranı türet.
- CDNA ortalama oranı, beklenen 1:1 oranında sapma değerlendirmek için genomik ortalama oranı ile bölün.
7) Deneysel Kontrolleri
- Deneysel eserler ekarte etmek için, deney en az üç kez tekrarlayın.
- Ek DNA belirteçleri Mümkün olduğunda, tasarım deneyleri.
- Hem ileri ve geri tellerine tavlama çoklu PCR primer çiftleri ve uzatma primerler tasarlayın.
- Aldığınızda DNA işaretleyicileri için heterozigot ama fenotipi ile ilişkili DNA risk türevleri yapmamaktadırlar negatif kontroller hücre hatları mümkün testi (Şekil 1 ve 3)
8) Temsilcisi Sonuçlar
Kütle spektrometresi izleri örnekler Şekil 3, allel spesifik ifade analizi bir örnek gösterilmiştir. Şekil 4 farklı şablonlar üzerinde yapılan 4 allel spesifik primer uzatma ürünleri analiz sonuçları göstermektedir. Üst grafikler transkripsiyonu kodlama polimorfizmi için heterozigot hem de iki farklı hücre hatları, genomik DNA analizinden elde edilen sonuçlar temsil eder. Ancak, sadece hücre hattı risk DNA varyantı (Şekil 1) için heterozigot. Düşük grafikler aynı hücre hatları elde edilen cDNA analizinden elde edilen sonuçlar temsil eder. Deneysel artifakı bir sonucu olarak ilk zirve, her zaman ikinci bir zirve bile genomik analiz daha yüksek. Bu nedenle, genomik analiz sonuçları cDNA veri normalleştirmek için kullanılır. Normalleştirme sonra, allel oranı anlamlı derecede farklı hücre hattı 1 A (ikinci zirve diğer spektrumları karşılaştırıldığında daha düşük göründüğü), veri bu hücre hattı öneririz B. 1 hücre hattı çok yakın iken A taşır DNA analiz altında gen ifadesi azaltır ikinci zirve ile ölçülen alleli ile faz varyant. Hücre B hattı çok uygun bir negatif kontrol sağlar.
Şekil 1. A ve B hücre hattı seçim stratejisi. Hücre dizileri ama sadece hücre hattı risk DNA varyantı (daire) için heterozigot bir transkripsiyonu kodlama işaretleyici (üçgen) heterozigot. Mavi risk varyant allel daha düşük bir seviyede transkripsiyon, (gerçek fonksiyonel varyant ile yakın bir ilişki içinde doğrudan bir etkisi olan ya da ya) ilişkilidir.
Şekil 2. Allel özel astar assay uzantısı. Bu rakam cDNA (solda) ve genomik DNA (sağda) şablonları için yapılan deneysel işlemin iş akış göstermektedir. PCR primerleri (gri dikdörtgenler) heterozigot kodlama polimorfizmi (üçgen) yükseltmek için tasarlanmıştır. Genomik kirlenme PCR primerleri amplifikasyon cDNA şablon üzerinde yapılan farklı ekzon (açık mavi bar) yerleştirilir dizileri tavlama önlemek için. PCR ürünü daha sonra polimorfizmi yanında bir baz tavlama bir uzantısı astar ile yürütülen bir astar uzatma reaksiyonu için şablon olarak kullanılır ve üç dideoxynucleotide uygun karışımlar (ddNTPs) sonlandırıcılar (kare) ve bir deoksinükleotid (daire) genişletmek için sırasıyla bir ya da iki temeli astar. Ortaya çıkan astar uzatma ürünleri MALDI-TOF kütle spektrometresi ile ayırma ve miktar izin farklı kitleler var. DNA marker mavi allel karşılık gelen ürün miktarı kırmızı allel nispeten düşüktür.
Şekil 3. Allel spesifik bir ifade testinin sonuçları. Rakam genomik DNA üzerinde yapılan analiz kütle spektrometresi sonuçları ve hücre hattı cDNA A ve B hücre hattı (Şekil 1) .
Discussion
Bu yöntem, transkript düzeyinde in vivo allel belirli bir fark değerlendirerek gen ekspresyonu hastalığı ile ilişkili DNA varyantlarının etkinin değerlendirilmesini sağlar . Bu protokol göreli transkript bolluk MALDI-TOF ama TaqMan 6,7 gibi allel spesifik kantifikasyon sağlayan diğer teknolojileri ile ölçülür kullanılabilir. Bu yaklaşımın en önemli kısıtlılığı, transkripsiyonu kodlama belirteçlerin durumu. Ilkesine dayalı yöntemler burada açıklanan, ancak farklı sınıflar polimorfizmleri yararlanarak tarif edilmiştir. HaploChip testi 1 kb II 8 polimeraz RNA spesifik antikorlar ile izole kromatin immunoprecipitated malzeme olacak bir gen transkripsiyonel başlangıç veya sonuna sitesi içinde yer belirleyicileri kullanarak allel spesifik ifade ölçer. Alternatif olarak, şablonu RNA 9 farkı çekirdekli zaman intronik SNP kullanılabilir.
Belirli bir protokol haploChip testi ile birlikte, burada açıklanan disleksi için aday gen (ya da okuma engelli) tanımlamak için başarıyla kullanılmaktadır. Başlangıçta bir genetik ilişki çalışmasında, disleksi kapsayan ve üç gen 10 ile ilgili bir DNA dizisi belirledi. Allel spesifik gen ekspresyonu assay disleksi ile ilişkili DNA varyantları ifade varyasyonu varlığı sadece biri için üç gen gözlenen ancak diğer iki 11 olduğunu gösterdi.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu iş için hibe yoluyla Wellcome Trust tarafından finanse edildi APM [076566/Z/05/Z] JCK [074.318] İnsan Genetiği için Wellcome Trust Merkezi çekirdek bir ödülü [075491/Z/04].Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma-Aldrich | P-4417-100TAB | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| NaCl | VWR international | 27788.366 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| RNase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-500MG | |
| Phenol: chloroform | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Chloroform | VWR international | 100777C | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | |
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich | DNTP100A | |
| Exonuclease 1 | New England Biolabs | M0293S | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | |
| SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | |
| MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | |
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | |
| Equipment | |||
| Chilled microcentrifuge | Eppendorf | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | ||
| SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |
References
- Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).
- Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide. PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).
- Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Allelic variation in human gene expression. Science. 297, 1143-11 (2002).
- Ding, C., Cantor, C. R. A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).
- Gabriel, S., Ziaugra, L. SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform. Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).
- Lo, H. S. Allelic variation in gene expression is common in the human genome. Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).
- Liu, X. Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation. Cancer Res. 65, 99-104 (2005).
- Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading. Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).
- Pastinen, T. A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression. Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).
- Francks, C. A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States. Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).
- Paracchini, S. The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration. Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).
