Summary
الجمعيات الجينية غالبا ما تظل غير المبررة على مستوى وظيفي. هذا الأسلوب يهدف إلى تقييم تأثير النمط الظاهري المرتبطة علامات وراثية على التعبير الجيني عن طريق تحليل الخلايا متخالف لالنيوكلوتايد كتب. وتتيح تقنية قياس دقيقة بواسطة مطياف الكتلة - TOF MALDI لتحديد أليل محددة تمديد التمهيدي المنتجات.
Abstract
عدد كبير من الجمعيات وراثية معقدة مع الصفات المشتركة في تزايد مستمر. ومع ذلك ، لم تكن معظم هذه الجمعيات المفهوم على المستوى الجزيئي. واحدة من آليات الوساطة تأثير المتغيرات الحمض النووي على الظواهر هو التعبير الجيني ، وهو ما ثبت أن تكون ذات أهمية خاصة لصفات معقدة 1.
هذا الأسلوب في الاختبارات السياق الخلوية تأثير تسلسل الحمض النووي محددة على التعبير الجيني. المبدأ هو لقياس الوفرة النسبية للمحاضر الناشئة عن الأليلات اثنين من الجينات ، وتحليل الخلايا التي تحمل نسخة واحدة من تسلسل الحمض النووي المرتبطة المرض (المتغيرات المخاطر) 2،3. لذا ، ينبغي أن الخلايا المستخدمة لهذا الأسلوب الوراثي تلبية شرطين أساسيين : يجب عليهم أن يكونوا متخالف سواء بالنسبة للمتغيرات المخاطر الحمض النووي DNA وعلامات ، الأشكال المتعددة الترميز عادة ، والتي يمكن تمييز النصوص على أساس أصلهم الكروموسومات (الشكل 1). المتغيرات مخاطر الحمض النووي DNA وعلامات لا حاجة الى تكرار الأليل نفسه ولكن في المرحلة (haplotypic) العلاقة بين علامات وراثية يجب أن يكون مفهوما. من المهم أيضا أن تختار أنواع الخلايا التي تعبر عن هذا الجين من الفائدة. هذا البروتوكول يشير تحديدا إلى الإجراء المعتمد لاستخراج الخلايا الليفية من الأحماض النووية ولكن هذه الطريقة تنطبق أيضا على أنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك الخلايا الأولية.
يتم استخراج DNA و RNA من خطوط الخلية المحددة ، ويتم إنشاؤها [كدنا]. ويتم تحليل الحمض النووي و[كدنا] مع التمهيدي مقايسة الإرشاد ، ومصممة لاستهداف علامات الحمض النووي الترميز 4. ويتم التمديد لفحص التمهيدي خارج باستخدام (Sequenom) MassARRAY 5 منصة وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. ثم يتم تحليل المنتجات تمديد التمهيدي بواسطة مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز الوقت / تأين الطيران مطياف الكتلة (MALDI-TOF/MS). لأن علامات المختارة هي متخالف فإنها تولد بين قمتين على ملامح MS. وتبلغ مساحة كل ذروة يتناسب مع وفرة نص ويمكن قياس مع وظيفة من برنامج من نوع MassARRAY لتوليد نسبة أليلية (أليل 1 : أليل 2) الحساب. هو تطبيع أليلية نسبة حصلت عليها لاستخدام [كدنا] أن يقاس من الحمض النووي الجيني ، حيث من المتوقع أن نسبة أليلية أن تكون لتصحيح 01:01 التحف الفنية. علامات مع نسبة لا تختلف كثيرا أليلية تطبيع إلى 1 تشير إلى أن كمية نص المتولدة من الكروموسومات اثنين في نفس الخلية مختلفة ، مما يدل على أن الحمض النووي المتغيرات المرتبطة النمط الظاهري يكون لها تأثير على التعبير الجيني. وينبغي أن تستخدم ضوابط التجريبية لتأكيد النتائج.
Protocol
1) خلية ثقافة
- حدد أنواع الخلايا التعبير عن الجينات في المصالح.
- حدد خطوط الخلايا متخالف كلا الخيارين لمخاطر الحمض النووي وكتب تعدد الأشكال الترميز داخل الجين من الفائدة (الشكل 1).
- ثقافة خطوط الخلية المحددة وفقا لمواصفات المورد وإعداد 2 × 10 سم أطباق بتري لاستخراج الحمض النووي الريبي ، وعلى التوالي.
- عندما الخلايا يصل إلى 80 ٪ التقاء بدء إجراءات لعزل الخلايا المحاصيل والدنا والرنا إما باتباع الإجراء المبين أدناه ، أو باستخدام أدوات متوفرة تجاريا.
2) استخراج الحمض النووي
- إزالة وسائل الاعلام من الطبق ، ويغسل مع برنامج تلفزيوني وإضافة إلى ميكرولتر 500 طبق من حل تحلل (0.6 ٪ SDS ، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 50 ملي تريس ، 20 ملي EDTA وميكروغرام / 50 مل ريبونوكلياز A).
- صخرة لوحة بلطف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- كشط lysate الخلية في أنبوب microcentrifuge واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- إضافة بروتين K إلى التركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- استخراج الحمض النووي مع حجم مساو من الفينول كلوروفورم - 8 أس هيدروجيني ، وتكرار ، ثم استخراج مع حجم مساو من كلوروفورم / كحول أيزو أميلي.
- ترسيب الحمض النووي مع 1 / كلوريد الصوديوم حجم ال 10 م 3 و 2.5 أحجام من الإيثانول بنسبة 100 ٪.
- يترك على الجليد لمدة 5 دقائق ثم تدور دورة في الدقيقة 13000 لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- غسل الحمض النووي مع الايثانول 70 ٪ ، والسماح ليجف في الهواء وresuspend في 200 ميليلتر من الشركة المصرية للاتصالات.
- احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم يترك لمدة 2 يوما في درجة حرارة الغرفة.
- المحل في 4 درجات مئوية على المدى الطويل أو على -20 درجة مئوية.
3) استخراج الحمض النووي الريبي
- إزالة وسائل الاعلام من الطبق ، ويغسل مع برنامج تلفزيوني ، إضافة 1 مل من TRIzol واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- خلايا كشط ، ماصة بضع مرات ، ونقل في أنبوب microcentrifuge واحتضان لمدة 5 دقائق.
- تدور لمدة 10 دقيقة في 10000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية.
- نقل طاف في أنبوب جديدة وإضافة 200 ميكرولتر من كلوروفورم.
- هزة وتدور لمدة 10 دقيقة في 10000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية.
- نقل المرحلة مائي في أنبوب جديد وإضافة حجم مساو من الايثانول 70 ٪.
- تحميل الحل إلى 1 أو 2 (حسب الحجم) العمود RNeasy وتدور لمدة 30 ثانية بسرعة قصوى.
- من هنا اتبع تعليمات من عدة RNeasy (Qiagen).
4) إعداد نموذج الأحماض النووية
- تحديد الحمض النووي الريبي وتركيز استخدام الطيف NanoDrop (الحرارية العلمية).
- يعد [كدنا] from 500-1000 نانوغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام decamers العشوائية ومرتفع الثالث عكس الناسخ (Invitrogen) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
5) PCR والفحص التمهيدي ملحق
- تصميم اثنين من أزواج من الاشعال PCR لكل علامة الحمض النووي ، وزوج واحد لتضخيم الحمض النووي الجيني والزوج الآخر لتضخيم [كدنا] (الشكل 2). مكان إلى الأمام وعكس التمهيدي لتضخيم [كدنا] exons متماثلة في مختلف لتجنب التلوث الجيني. التصميم التمهيدي للحصول على منتج PCR في نطاق طول غليان 100-500.
- إعداد 10 ميكرولتر تفاعل PCR بما في ذلك 0.5 طق Immolase U (Bioline) dNTPs ملي 0.8 ، 2 مم MgCl 2 ، 0.2 م كل التمهيدي و 20 نانوغرام إما [كدنا] أو الحمض النووي. تضخيم كل عينة في أربعة ردود الفعل المستقل.
- تشغيل تفاعل PCR في ظل الظروف الأمثل لكل زوج التمهيدي حفظ عدد دورة في المرحلة الخطية من التضخيم.
- إزالة PCR التمهيدي وdNTPs الزائد عن طريق احتضان المنتج PCR مع نوكلياز خارجية الأول والفوسفاتاز القلوية الروبيان (SAP) في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- بقعة كل منتج PCR مرتين على طبق من 384 جيدا ، بحيث 8 القياسات سوف تكون متاحة لكل عينة.
- التصميم التمهيدي التمديد مع برنامج الفحص (Sequenom) تصميم بحيث يمكن استخدام نفس التمهيدي لمنتجات كلا PCR الجينومية و[كدنا]. تحديد طول التمهيدي في نطاق 14-18 سنة مضت بما في ذلك التمديد ومزيج من تركيبات 3ddNTPs (الشكل 2).
- تنفيذ ردود الفعل والتحليل التمهيدي تمديد MALDI-TOF/MS باستخدام نظام MassARRAY (Sequenom) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- ملحق التمهيدي نموذجية تشمل رد فعل خطوة ابتداء من 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، تليها 40 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 5 ليالي و 52 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و 72 درجة مئوية لمدة 5 ثانية.
- يتم تنظيف المنتجات تمديد التمهيدي مع الراتنج SpectroCLEAN ونقل على ميكروأري (رقاقة) من خلال موزع nanolitre SpectroPOINT.
- وكميا [أليغنوكليوتيد] مدد - TOF MALDI باستخدام مطياف الكتلة SpectroREADER.
6) التحليل الإحصائي
- التحقق من نتائج MALDI-TOF/MS مع برنامج من نوع MassARRAY للجودة عام من التجربة.
- استخراج تقرير Allelotyping الذي يتضمن بيانات منطقة الذروة.
- لكل فرد حساب الطيفالنسبة بين منطقة ذروة أليل 1 و أليل 2 (الذروة نسبة المساحة).
- لكل عينة [كدنا] اشتقاق نسبة منطقة الذروة تعني والانحراف المعياري ، وذلك باستخدام وظيفة المناظرة في Excel ، عبر قياسات 8.
- اشتقاق نفس المنطقة يعني نسبة الذروة عبر قياسات 8 لالحمض النووي الجيني.
- [كدنا] تقسيم نسبة يعني نسبة متوسط الجينومية لتقييم هذا الانحراف إلى نسبة 1:1 من المتوقع.
7) التجريبية التحكم
- استبعاد الأعمال الفنية التجريبية ، وتكرار تجربة ما لا يقل عن ثلاث مرات.
- كلما كان ذلك ممكنا المقايسات التصميم والحمض النووي للعلامات إضافية.
- تصميم عدة أزواج التمهيدي PCR والاشعال تمديد الصلب إلى فروع كل من الأمام والعكس.
- كلما كان ذلك ممكنا اختبار كما سلبية خطوط الخلايا التي يتم التحكم عن علامات الحمض النووي متغايرة ولكنها لا تحمل مخاطر المتغيرات المرتبطة الحمض النووي النمط الظاهري (الشكل 1 والشكل 3)
8) الممثل النتائج
ويرد مثال على أليل محددة تحليل التعبير في الشكل (3) مع أمثلة من آثار مطياف الكتلة. هذا الرقم يدل على النتائج من خلال تحليل 4 أليل محددة من المنتجات تمديد التمهيدي نفذت في 4 قوالب مختلفة. الرسوم البيانية للأعلى تمثل النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل الحمض النووي الجيني اثنين من خطوط الخلايا المختلفة ، والتي هي على حد سواء متخالف لتعدد الأشكال كتب الترميز. ومع ذلك ، خط خلية فقط A هو متخالف لمخاطر البديل DNA (الشكل 1). انخفاض الرسوم البيانية تمثل النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل [كدنا] المتولدة من خطوط الخلية نفسها. نتيجة لقطعة أثرية التجريبية ذروة الأولى هي دائما أعلى من الذروة الثانية حتى في التحليل الجيني. لذلك ، يتم استخدام النتائج من خلال التحليل الجيني لتطبيع البيانات [كدنا]. بعد التطبيع ، نسبة أليل يختلف كثيرا عن 1 في خط الخلية A (حيث الذروة الثانية يبدو أقل بالمقارنة مع الأطياف الأخرى) ، في حين أنه قريب جدا من خط 1 في الخلية باء وتشير البيانات إلى أن خط الخلية ويحمل الحمض النووي المتغير ، في المرحلة مع أليل تقاس الذروة الثانية ، مما يقلل من التعبير عن الجينات قيد التحليل. الخلية B خط يوفر سيطرة مريحة للغاية السلبية.
الشكل 1. خطوط خلية خلية استراتيجية اختيار خط ألف وباء ومتخالف للعلامة كتب الترميز (المثلث) ، ولكن خط الخلية فقط هي البديل عن متخالف الحمض النووي للخطر (دائرة). يرتبط أليل الزرقاء من مخاطر البديل (إما مع وجود تأثير مباشر أو لأن في الارتباط الوثيق مع المتغير الوظيفية الفعلية) مع انخفاض مستوى النسخ.
الشكل 2. أليل محددة تمديد مقايسة التمهيدي ، وهذا الرقم يظهر تدفق العمل لتنفيذ الإجراء التجريبي لكل من الحمض النووي [كدنا] (يسار) والجينوم (يمين) القوالب. صممت PCR الاشعال (المستطيلات الرمادية) لتضخيم تعدد الأشكال متخالف الترميز (المثلث). لتجنب التلوث الجيني PCR الاشعال يصلب متواليات وضعت في exons متماثلة مختلفة (الحانات ضوء أزرق) عندما يتم تضخيم خارجا على قالب [كدنا]. ثم يتم استخدام المنتج PCR كقالب لتتعرف رد فعل تمديد نفذت التمهيدي مع التمديد ، الصلب على قاعدة بجانب تعدد الأشكال ، والمزيج المناسب من ثلاثة dideoxynucleotide (ddNTPs) الإنهاء (المربعات) وواحدة deoxynucleotide (دائرة) ليمتد التمهيدي من أساس واحد أو اثنين على التوالي. تمديد التمهيدي الناتجة المنتجات والجماهير المختلفة التي تسمح للفصل وتقدير من قبل مطياف الكتلة - TOF MALDI. كمية المنتج المطابق للأليل الزرقاء من الحمض النووي هو علامة أقل نسبيا لأليل الحمراء.
الشكل 3. نتائج الأليل محددة مقايسة التعبير. الشكل تظهر نتائج مطياف الكتلة من التحليل الذي أجري على الحمض النووي الجيني و[كدنا] من خط الخلية A و B خط الخلية (الشكل 1).
Discussion
هذه الطريقة تمكن من تقييم تأثير الأمراض المرتبطة المتغيرات الحمض النووي على التعبير الجيني عن طريق تقييم الفرق في الجسم الحي محددة أليل في مستوى النص. في هذا البروتوكول هو قياس وفرة نسبية من خلال نص TOF MALDI ، ولكن غيرها من التكنولوجيات السماح الكمي أليل محددة ، مثل TaqMan 6،7 ، يمكن استخدام. القيد الرئيسي لهذا النهج هو توافر كتب علامات الترميز. ووصف الأساليب على أساس مبدأ هنا ، ولكن الاستفادة من فئات مختلفة من الأشكال المتعددة ، وقد وصفت. في مقايسة haploChip تدابير محددة أليل التعبير باستخدام علامات يقع في حدود 1 كيلو بايت من بداية النسخي أو موقع نهاية الجين الذي سيكون حاضرا في لونين immunoprecipitated المواد المعزولة مع الأجسام المضادة المحددة لرنا بوليميريز الثاني 8. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام intronic النيوكلوتايد عندما القالب heteronuclear RNA 9.
وصف بروتوكول معين هنا ، في تركيبة مع مقايسة haploChip ، وقد استخدم بنجاح لتحديد الجينات مرشح لعسر القراءة (القراءة أو العجز). في البداية حددت دراسة جمعية الوراثية DNA تسلسل المرتبطة عسر القراءة والذي يمتد ثلاثة جينات 10. اظهر أليل محددة التعبير الجيني في الفحص ان وجود عسر القراءة المرتبطة اختلاف الحمض النووي التعبير عن المتغيرات لوحظ واحد فقط من الجينات الثلاثة ولكن ليس ال 11 الأخرى اثنين.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم ترست من خلال منح لAPM [076566/Z/05/Z] ، JCK [074318] وجائزة الأساسية للمركز ويلكوم ترست لعلم الوراثة البشرية [075491/Z/04].Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma-Aldrich | P-4417-100TAB | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| NaCl | VWR international | 27788.366 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| RNase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-500MG | |
| Phenol: chloroform | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Chloroform | VWR international | 100777C | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | |
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich | DNTP100A | |
| Exonuclease 1 | New England Biolabs | M0293S | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | |
| SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | |
| MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | |
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | |
| Equipment | |||
| Chilled microcentrifuge | Eppendorf | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | ||
| SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |
References
- Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).
- Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide. PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).
- Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Allelic variation in human gene expression. Science. 297, 1143-11 (2002).
- Ding, C., Cantor, C. R. A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).
- Gabriel, S., Ziaugra, L. SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform. Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).
- Lo, H. S. Allelic variation in gene expression is common in the human genome. Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).
- Liu, X. Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation. Cancer Res. 65, 99-104 (2005).
- Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading. Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).
- Pastinen, T. A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression. Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).
- Francks, C. A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States. Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).
- Paracchini, S. The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration. Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).
