Summary
遗传协会经常保持在功能级别上的原因不明。这种方法的目的是，通过分析细胞转录单核苷酸多态性杂合子基因表达，以评估的表型相关的遗传标记的影响。该技术可以精确测量，用MALDI - TOF质谱定量等位基因特异性引物延伸产品。
Abstract
与常见的复杂特征显着的遗传协会的数量不断增加。然而，这些协会的大多数并没有被理解在分子水平上。介导的DNA变异的表型的影响的机制之一是，这已被证明特别是对复杂性状1相关的基因表达。
这种方法测试蜂窝上下文特定的DNA序列，基因表达的影响。其原理是相对丰度测量所产生的一个基因的两个等位基因，分析细胞进行与疾病（风险变种）2,3相关的DNA序列的一个副本成绩单。因此，这种方法使用的细胞应该满足了两个基本基因型要求：他们必须为DNA风险的变种和DNA分子标记，通常的编码基因多态性，基于他们的染色体的起源（图1）可以区分成绩单的杂合子。 DNA风险的变种和DNA标记不需要具有相同的等位基因频率，但阶段（haplotypic）的遗传标记的关系，需要理解。同样重要的是，选择感兴趣的基因的细胞类型，表达。此协议专指通过从成纤维细胞中提取核酸的过程，但该方法是同样适用于其他细胞类型，包括原代细胞。
从选定的细胞株DNA和RNA的提取和cDNA的生成。 DNA和cDNA进行了分析与设计目标编码DNA标记4，一个引物延伸实验。引物延伸实验进行使用MassARRAY（Sequenom公司）5平台，根据制造商的规格。引物延伸产品，然后分析了基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）时间。由于选定的标记是杂合子，他们将生成两个山峰上的MS情景。每个峰的面积是成正比的转录丰度和可与MassARRAY导电型测量仪软件功能生成一个等位基因的比例（等位基因1：等位基因2）测量计算。等位基因的cDNA获得的比例是使用从基因组DNA，其中等位基因的比例预计为1:1，以正确的技术构件规范化。与归一化的等位基因的比例显着不同的为1的标记表明，两个在同一个细胞的染色体产生的成绩单金额是不同的，这表明DNA与表型相关的变种基因表达的影响。应该用实验控制，以确认结果。
Protocol
1）细胞培养
- 选择感兴趣的基因表达的细胞类型。
- 选择DNA风险的变种和转录编码内感兴趣的基因多态性（图1）杂合子的细胞株。
- 文化所选单元格的行根据供应商的规格，并准备分别为2 × 10厘米的培养皿中，DNA和RNA的提取。
- 当细胞达到80％汇合时启动程序，收获细胞，DNA和RNA的隔离遵循下述步骤或使用市售的试剂盒。
2）DNA的提取
- 从盘取出介质，用PBS清洗，并添加到菜500μL裂解液（0.6％SDS，氯化钠100毫米，50毫米的Tris，20 mM的EDTA和50μg/ mL的RNA酶A）。
- 岩石板，轻轻地在室温下20分钟。
- 在37 ° C过夜，刮的离心管中，并培育成的细胞裂解液。
- 加入蛋白酶K至终浓度为100微克/毫升和37℃过夜孵育。
- 与等体积酚 - 氯仿的pH值8，重复提取DNA，然后与等体积的氯仿/异戊醇提取。
- 1 / 10体积3 M氯化钠和2.5卷100％的乙醇沉淀的DNA。
- 留在冰浴5分钟，然后在30分钟13000转，旋转4 ° C。
- 用70％乙醇清洗DNA，使空气干燥，在200μL的TE悬浮。
- 在65℃孵育10分钟，然后在室温下2天离开。
- 保存在4 ° C或长期在-20 ° C
3）RNA的提取
- 从盘取出介质，用PBS清洗，添加1毫升的Trizol，并培育在室温下10分钟。
- 刮下的细胞，吸离心管几次，转让和孵育5分钟。
- 以10,000 rpm 10分钟旋转4 ° C。
- 转移在一个新的管的上清，加入200μl氯仿。
- 猛烈摇动并以10,000 rpm 10分钟旋转4 ° C。
- 在一个新的管水阶段转移和70％的乙醇添加量相等。
- 负载的解决方案，以1或2（上卷而定）的RNeasy列和旋转的最大速度为30秒。
- 从这里遵循的RNeasy试剂盒（Qiagen）的指令。
4）核酸样品制备
- 量化的DNA和RNA的浓度，使用NanoDrop分光光度计（Thermo Scientific的）。
- 准备从500-1000吴RNA根据制造商的指示使用随机decamers和标三反转录酶（Invitrogen公司）的cDNA。
5）PCR引物延伸实验
- 设计两对PCR引物，每个DNA分子标记，基因组DNA扩增的一对，另一对cDNA扩增（图2）。广场正向和反向在不同的外显子cDNA扩增引物，以避免基因污染。设计引物，在100-500 bp的长度范围内获得的PCR产物。
- 准备10μL包括0.5 U Immolase TAQ（Bioline）0.8毫米dNTPs，MgCl 2的 2毫米，0.2米的引物和20纳克cDNA或DNA的PCR反应。每个样品的扩增4个独立的反应。
- 每个引物对保持线性相位的扩增循环数的优化条件下运行的PCR反应。
- 取出孵化与核酸外切酶的PCR产物，PCR引物和dNTPs过剩我和虾碱性磷酸酶（SAP）的，在37 ° 20分钟。
- 现货在384孔板每两次PCR产物，因此，8测量每个样品。
- 设计与实验设计（Sequenom公司）软件的延伸引物，使相同的引物可用于基因组和cDNA PCR产物。引物长度在14-18 bp和延伸组合，包括3ddNTPs组合（图2）的范围内指定。
- 开展引物延伸反应和MALDI-TOF/MS分析，根据制造商的指示使用MassARRAY系统（Sequenom公司）。
- 一个典型的引物延伸反应，包括2分钟94步° C，5秒94 ° C，40个周期为5秒，5秒，52℃72℃
- 引物延伸产品SpectroCLEAN树脂清洗，并转移到芯片（芯片）SpectroPOINT纳升级饮水机。
- 扩展的寡核苷酸使用SpectroREADER质谱仪的MALDI - TOF量化。
6）统计分析
- 检查MALDI-TOF/MS与实验的总质量MassARRAY导电型测量仪软件结果。
- 提取Allelotyping的报告，其中包括峰面积数据。
- 对于每个单独的频谱计算等位基因1和等位基因2（峰面积之比）的峰面积之间的比率。
- 对于每个cDNA样本推导出一个峰面积比值的均值和标准差，使用相应的功能，在Excel中，横跨8测量。
- 推导出整个基因组DNA的8 measurments相同的平均峰面积之比。
- 由基因组的平均比率评估偏离预期的1:1的比例分成的cDNA的平均比例。
7）实验控制
- 为了排除实验文物，至少有三次重复实验。
- 只要有可能，额外的DNA分子标记的设计分析。
- 设计多重PCR引物对和延伸引物退火正向和反向链。
- 每当可能的测试，作为阴性对照细胞株，为DNA分子标记杂合，但不进行风险与表型相关的DNA变异（图1和图3。）
8）代表性的成果
等位基因特异性表达分析的一个例子是在质谱痕迹的例子图3所示。该图显示了从4等位基因特异性引物延伸产品4种不同的模板进行分析的结果。顶部的图形表示，从两个不同的细胞系，这都是一个转录的编码基因多态性杂合子基因组DNA的分析得到的结果。然而，只有细胞系，一个是风险的DNA变异（图1）杂合子。较低的图形代表从相同的细胞系产生的cDNA进行分析得出的结果。作为一个实验神器的第一个高峰期总是高于的第二个高峰期，即使在基因组分析。因此，从基因组分析的结果用于正常化的cDNA数据。正常化后，等位基因的比例从1细胞株显着不同（其中的第二个高峰期出现低比其他光谱），虽然这是非常密切的细胞株为1 B.数据表明，细胞系一个带有DNA的变种，测量的第二个高峰期，从而降低了在分析基因表达的等位基因的阶段。细胞B线提供了十分便利的阴性对照。
图1。 A和B细胞株细胞系的选择策略 。编码一个转录标记（三角形）的杂合子，但只有一个是对风险的DNA变异（圆圈）杂合子的细胞系。蓝色的风险变异等位基因关联（直接的效果，或在与实际的功能变异密切相关，因为）的转录水平较低。
图2。等位基因特异性引物延伸实验。这个数字表明双方的cDNA和基因组DNA（左）（右）模板进行的实验过程的工作流程。 PCR引物（灰色矩形）放大一个杂合的编码基因多态性（三角形）。为了避免基因污染PCR引物退火序列放置在不同的外显子（淡蓝色酒吧）cDNA为模板进行扩增时。 PCR产物为模板，然后用一个引物延伸反应进行扩展底漆，退火一个基地旁边的多态性，三个双脱氧适当搭配（ddNTPs）终结符（正方形）和一个脱氧核苷酸（圈），以延长一个或两个的基础上底漆。所产生的引物延伸产品，允许不同的分离和MALDI - TOF质谱定量群众。相应的蓝色基因的DNA标记的产品的数量是相对较低的红色等位基因。
图3。一个等位基因特异性表达检测结果。数字显示质谱分析进行基因组DNA和细胞株的基因A和细胞B线（图1） 。
Discussion
这种方法使体内等位基因特异性转录水平的差异，评估评价疾病相关基因表达的DNA变异的影响。在这个协议中的相对转录丰度的MALDI - TOF，但其他技术允许，如TaqMan探针6,7，等位基因特异的定量测量，都可以使用。这种方法的主要限制是转录编码标记的可用性。这里描述的方法原则的基础上，但利用不同类别的多态性，已描述。 haploChip检测措施，使用1 KB的转录的开始或结束一个基因，这将是在与特定RNA 聚合酶 II 8的抗体染色质免疫沉淀隔离材料的网站内的标记的等位基因特异性表达。此外，内含子单核苷酸多态性模板时，可以使用异RNA 的 9 。
这里描述具体的协议，与haploChip检测相结合，已成功地用于确定为读写障碍的候选基因（或阅读障碍）。最初遗传关联研究，发现与诵读困难和这是跨越3个基因的10相关的DNA序列。等位基因特异的基因表达检测结果显示，在存在的诵读困难相关的DNA变异的表达变化，发现只有三个基因中的一个，但不是其他两个11。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
通过赠款，这项工作是由威康信托基金资助的APM [076566/Z/05/Z]，JCK [074318]和威康信托中心人类遗传学的核心奖[075491/Z/04]。Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma-Aldrich | P-4417-100TAB | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| NaCl | VWR international | 27788.366 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| RNase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-500MG | |
| Phenol: chloroform | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Chloroform | VWR international | 100777C | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | |
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich | DNTP100A | |
| Exonuclease 1 | New England Biolabs | M0293S | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | |
| SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | |
| MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | |
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | |
| Equipment | |||
| Chilled microcentrifuge | Eppendorf | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | ||
| SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |
References
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