Summary
Stabiel isotopische profilering door middel van gaschromatografie massaspectrometrische analyse van intermediaire metabole flux wordt beschreven in de nematode,
Abstract
Stabiele isotopen profilering is al lang toegestaan gevoelige onderzoeken van de metabole gevolgen van genetische mutaties en / of farmacologische behandelingen in cellulaire en zoogdieren modellen. We beschrijven hier gedetailleerde methoden om stabiele isotopen profilering van intermediaire metabolisme en metabole flux uit te voeren in de nematode, Caenorhabditis elegans. Methoden beschreven voor het profileren van hele worm vrije aminozuren, gelabeld koolstofdioxide, gemerkt organische zuren, en gelabeld aminozuren in de dieren blootgesteld aan stabiele isotopen, hetzij vanaf de vroege ontwikkeling op nematode groeimedia agar platen of begin als jonge volwassenen maar blootgesteld aan diverse farmacologische behandelingen in vloeibare cultuur. Vrije aminozuren worden gekwantificeerd door de hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) geheel worm porties gewonnen in 4% perchloorzuur. Universeel label 13 C-glucose of 1,6 - 13 C 2-glucose wordt gebruikt als de stabiele isotopen voorloper van wie het label koolstof wordt opgespoord door middel van massaspectrometrie in koolstofdioxide (zowel atmosferische en opgelost), alsmede in metabolieten indicatie van de flux door de glycolyse , pyruvaat metabolisme, en de citroenzuur-cyclus. Representatieve resultaten zijn opgenomen om effecten van de isotoop belichtingstijd, verschillende bacteriële clearing protocollen, en alternatieve worm verstoring methoden aan te tonen in wild-type nematoden, evenals de relatieve omvang van isotopische incorporatie in het mitochondriale complex III mutant wormen (isp-1 (qm150) ) ten opzichte van wild-type wormen. Toepassing van stabiele isotopen profilering in het leven nematoden biedt een nieuwe mogelijkheid om te onderzoeken op het hele dier niveau real-time metabole veranderingen die veroorzaakt worden door individuele genetische stoornissen en / of farmacologische therapieën.
Protocol
Protocol A: Stabiele isotopen profilering van intermediaire metabolisme tijdens de C. elegans ontwikkeling op NGM platen.
* Opmerking: Stabiele isotoop verrijking met succes kan worden gemeten bij jonge volwassenen nematode populaties volgende isotoop blootstelling (met of algemeen-gelabelde 13 C glucose of 1,6 - 13 C 2-glucose) het begin of in de vroege ontwikkeling of in de vroege volwassenheid. Dit protocol maakt gelijktijdige bewaking van de gezondheid van dieren, ontwikkeling, en groei op de standaard nematode groei media (NGM) platen, die niet zo gemakkelijk te bereiken in vloeibare cultuur.
- Bereid 100 mm petrischaaltjes met 10 ml van nematoden groei media (NGM), per standaard techniek 1.
- Spread NGM platen met OP50 E. coli 1 en laten drogen 's nachts.
- Voeg 500 ul van 200 mM 1,6 - 13 C 2 glucose (tot een uiteindelijke concentratie van 10 mm op NGM plaat te bereiken) gelijkmatig op de plaat. Laat een nacht drogen.
- Bleach gravid volwassen wormen 1. Plaat hersteld eieren op NGM platen zonder bacteriën of 1,6 - 13 C 2 glucose. Incubeer bij 20 ° C gedurende de nacht.
- De volgende dag, transfer uitgekomen, L1-larven gearresteerd op NGM platen die eerder verspreid met 1,6 - 13 C 2-glucose en OP50 E. coli (per stap # 2, hierboven). Grow wormen aan jonge volwassen stadium (48-72 uur, afhankelijk van de stam), doe zorg wormen niet verhongeren.
- Verzamel synchroon, de eerste dag jong volwassen wormen van borden met 3-4 ml van S. Basale.
- Was de wormen in 50 ml S. Basal in 50 ml Falcon buizen. Laat wormen pellet door de zwaartekracht gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant tot ~ 5 ml. Herhaal dit nog twee keer wassen.
- Schatting aantal worm door het tellen van drie 100 ul monsters 2. Stel worm concentratie tot 1000 wormen / mL van S. basale.
- Pipetteer 1 ml (1000 wormen) in een 1,5 ml plastic centrifugebuis.
- Voeg 69 ul van 60% partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst met interne standaard (ε-aminocapronzuur) tot een uiteindelijke concentratie van 4% PSO en 200 umol interne standaard.
- Laat wormen af te wikkelen door de zwaartekracht x 5 minuten. Verwijder en bewaar de bovenstaande vloeistof in een andere buis.
- Grind worm monsters met behulp van plastic homogenisator (Kontes Pellet Stamper) en gemotoriseerde boren (Kontes Pellet Stamper Cordless Motor) voor een 15 seconden. Bevestig visueel worm verstoring door licht microscopie. Herhalen indien nodig.
- Breng de bovenstaande vanaf stap # 11 tot en met homogenaat combineren van stap # 12.
- Centrifugeer monster op 2250 rpm (1300 xg) voor 5 minuten.
- Overdracht supernatant in de frisse 7 ml glazen buis. Sparen pellet voor eiwitconcentratie test, zoals beschreven in stap # 20, hieronder.
- pH monsters 7-8 (neutraal) bereik met 4N KOH.
- Centrifuge geneutraliseerd monsters in 7 ml glazen buis bij 2.250 tpm (1300 xg) gedurende 5 minuten om zouten te verwijderen.
- Overdracht supernatant in de frisse 7 ml glazen buis.
- Bereid geneutraliseerd monsters metaboliet kwantificering door:
- High Performance Liquid Chromatography (HPLC): Aparte 50 ul van geneutraliseerd monster voor directe injectie in HPLC. Vrije aminozuren kwantificatie wordt uitgevoerd door HPLC (Varian) met behulp van pre-column derivatisering met o-ftalaldehyde en fluorescerende detectie, zoals eerder beschreven 3-4.
- Gaschromatografie / massaspectrometrie (GC / MS): Ga door met extractie van de resterende geneutraliseerd monsters met behulp van de ionenwisselaar (Bio-Rad) voor de GC / MS bepaling van de isotopische verrijking in aminozuren en organische zuren, zoals omschreven in PROTOCOL D.
- Voeg 1 ml 1N NaOH om de resterende eiwit pellet (van stap # 15) in 7 ml glazen buis.
- Incubeer NaOH behandeld eiwitmonster bij kamertemperatuur tijdens het draaien (LabNet * LabRoller Rotator) 's nachts totdat het is opgelost.
- Gebruik 75 tot 100 ul van NaOH behandeld eiwit bewerkt om de concentratie vast te stellen door middel van standaard methoden (DC Protein Assay, Bio-Rad).
Protocol B. Stabiele isotopen profilering van intermediaire metabolisme in C. elegans jonge volwassenen in vloeibare cultuur.
* OPMERKING: farmacologische effecten van intermediaire metabolische flux bij volwassen nematoden kan worden onderzocht na isotoop blootstelling vanaf de eerste dag van de eileg, hetzij op NGM borden (zie Protocol A, boven) of in vloeibare cultuur. We geven de voorkeur aan deze laatste benadering van de kostenefficiëntie van stabiele isotopen en farmacologische stof maximaal te benutten.
- Verdunnen synchroon, de eerste dag eierleggende jonge volwassenen in S. basale met 0,0005% cholesterol (verkregen door het toevoegen van 0,5 ml van 1% cholesterol (opgelost in 95% ethanol) 1L van S. Basal) tot 2000 dieren per 500 pi.
- Stel ~ 4 mL totaal volume cultuur (s) in 25 ml erlenmeyers, als volgt:
BEHANDELING: NONE "DRUG A" S. Basale met cholesterol 3020 pi 3020 uL - "Drug A" volume Stabiele isotoop (1,6 - 13 C 2-glucose) 80 pi 80 pi K12 E. coli (OD 660 2,5-3) 400 uL 400 uL Young Adult Worms (2000) 500 pL 500 pL Geneesmiddel A (gewenste concentratie) - Als de gewenste - Bedek kolven met folie. Schud kolven gedurende 24 uur bij 220 rpm in 20 ° C geïncubeerd platform shaker.
- Zorg ervoor dat flessen zijn niet volledig afgesloten, zoals zuurstof nodig is voor intermediair metabole flux en voor de etikettering als gevolg van endogene nematode metabolieten.
- Was wormen door het toevoegen van 4 ml cultuur volume tot 46 ml van S. basale in een 50 ml conische plastic buis. Laat wormen pellet door de zwaartekracht gedurende 5 minuten. Afzuiging supernatant tot ~ 5 ml blijft. Herhaal de wasbeurt te hervullen tube nog twee keer tot 50 ml met S. basale.
- Concentreer gewassen wormen tot 1000 wormen / mL in een 1,5 ml plastic centrifugebuis.
- Voeg 69 ul van 60% perchloorzuur (PCA) en 2 pi van 10 pM interne standaard (ε-aminocapronzuur) tot een uiteindelijke concentratie van 200 micromol interne standaard en 4% PCA te bereiken.
- Bereid monsters per stappen # 11-22 in Protocol A
PROTOCOL C-1. Monitoring isotopen gebruik in volwassen wormen op de borden door het traceren van het label koolstof in de atmosfeer en de opgeloste kooldioxide.
* OPMERKING: Overwegende dat de PROTOCOLLEN A en B detail methoden voor het isotoop opname te controleren in het vrije metabolieten binnen wormen meer dan 2-3 dagen van ontwikkeling of een dag van het volwassen leven, respectievelijk bruto bevestiging van het succes en de kinetiek van isotopen oprichting over een korte tijdsverloop (dat wil zeggen, minuten tot uren) kunnen worden bereikt door een label in de atmosferische kooldioxide (CO 2) vrijkomt uit wormen of in opgeloste kooldioxide in worm extract. Live of gedode bacteriën kunnen worden gevoerd aan wormen als gekweekt op platen (PROTOCOL C-1). Bacteriën is niet nodig voor de korte termijn isotoop blootstelling van wormen in vloeibare cultuur (PROTOCOL C-2).
- Bereid 100 mm petrischaaltjes met 10 ml van NGM agar. Spread NGM platen met een live-of UV-gedode OP50 E. coli (zoals aangetoond in Figuur 1). Laat platen te drogen 's nachts.
- Voeg 500 ul van 200 mM 1,6-label-13 C 2-glucose tot OP50 verspreiden NGM platen (voor definitieve isotoop concentratie van 10 mm op NGM plaat). Laat platen te drogen 's nachts.
- Verkrijgen van synchroon, de eerste dag leg, jong volwassen wormen gekweekt op NGM agarplaten verspreid alleen met OP50 E. coli.
- Transfer 1000 jong volwassen wormen tot experimentele NGM agarplaten die stabiele isotopen en E. coli (bereid volgens de stappen 1-2, boven).
- Plaats experimentele NGM plaat (zonder deksel) in aangepaste glazen kamer uitgerust met een goed gesloten 3-weg kraan te laten voor een nauwkeurige sfeer bemonstering en vervanging. Onmiddellijk seal kamers met optisch transparant glas disc. Cover naad waar de glazen schijf zit op plaat met hoog vacuüm vet afdichting. Recordtijd als "Time 0".
- Voorbeeld 10 mL van de atmosfeer van de glazen kamer met 3-weg kraan met een 20 ml spuit op 30, 60, 90 en 120 minuten. Breng elke atmosferische monster op een vooraf opgestelde 10 mL rubberen stop bovenaan glazen buisje met 1 ml van 1 mM NaHCO 3 in 0,1 N NaOH dat is vacuüm afgesloten.
- Injecteer 10 ml van de lucht terug in elk glas kamer door middel van 3-weg kraan met behulp van een 20 ml spuit. Dicht kraan naar kamer na de monsterneming / reinjecting sfeer en voor het hervatten incubatietijd tussen de verzameling tijdstippen.
- Injecteer 100 pl van 20% fosforzuur door de stop in 10 ml rubberen stop bovenaan glazen buisje met atmosferische CO 2 monster.
- Verwijder 2 mL van de atmosfeer en te injecteren in 12 ml blue-top auto-sampler buizen pre-gevuld met helium voor de atmosferische CO 2-meting.
- Analyseer "atmosferische CO 2 monsters" door Gas-ratio massaspectrometer (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
- Open glazen kamers na twee uur isotoop incubatietijd en het verzamelen van alle atmosferische monsters.
- Was wormen off van NGM platen met behulp van 3 ml van S. basale.
- Was de wormen in 50 ml S. basale in 50 ml Falcon buizen. Herhaal dit was nog twee keer.
- Concentreer wormen ~ 1000 wormen / ml in 7 mL ronde bodem glazen buis (s).
- Vacuum seal glazen buis met rubberen stop.
- Voeg 100 ulvan 20% fosforzuur door middel van rubberen stop met een spuit vrij te geven opgelost CO 2.
- Verwijder 2 mL van de atmosfeer en injecteer in 12 ml blue-top auto-sampler buizen pre-gevuld met helium voor opgeloste CO 2-meting.
- Analyseer "opgelost CO 2 monsters" door Gas-ratio massaspectrometer (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
Alternatief protocol (C-2): Monitoring isotopische gebruik in volwassen wormen in vloeibare cultuur door het traceren van het label koolstof in de atmosfeer en de opgeloste kooldioxide.
- Verkrijgen van synchroon, de eerste dag leg, jong volwassen wormen gekweekt op NGM agarplaten verspreid met OP50 E. coli.
- Was de wormen in 50 ml S. basale in 50 ml Falcon buizen. Laat wormen pellet door de zwaartekracht gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant tot ~ 5 ml. Herhaal dit nog twee keer wast.
- Transfer 1000 jonge volwassen wormen in 1 mL S. basale tot 10 ml ronde bodem glazen buis. Voeg 10,1 ul van 1 M voorraad van algemeen-gelabeld 13 C-glucose tot 1 ml van wormen tot de uiteindelijke concentratie van 10 mM te bereiken.
- Zuurstof de ronde bodem glazen buis met wormen en isotopen door het uitwisselen van sfeer met vloeiende 100% zuurstof in open buis gedurende 2 minuten. Onmiddellijk nauwe buis met rubberen stop.
- Schud experimentele buizen in 20 ° C geïncubeerd platform schudinrichting bij 220 tpm. Record starttijd als "Time 0".
- Monster 5 ml van de atmosfeer van 10 ml ronde bodem glazen buis met behulp van een 10 ml spuit en 25 gauge naald door de rubberen stop op 30, 60, 90 en 120 minuten.
- Breng elke atmosferische monster op een vooraf opgestelde, rubberen stop bovenaan 10 ml glazen buis met daarin 1 ml van 1 mM NaHCO 3 in 0,1 N NaOH dat is vacuüm afgesloten.
- Injecteer 5 ml lucht weer terug in elke experimentele ronde bodem glazen buis met wormen en isotopen door middel van rubberen stop met behulp van een 10 ml spuit en 25 gauge naald.
- Resume incubatie van experimentele 10 ml ronde bodem glazen buizen met wormen en isotoop door uitschudden bij 220 toeren per minuut tussen de verzameling tijdstippen.
- Injecteer 100 pl van 20% fosforzuur door de stopper in de atmosfeer met een rubberen dop bovenop 10 ml glazen buis.
- Verwijder 2 mL van de atmosfeer en injecteer in 12 ml blue-top auto-sampler buizen pre-gevuld met helium voor de atmosferische CO 2-meting.
- Analyseer "atmosferische CO 2 monsters" door Gas-ratio massaspectrometer (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
- Op het einde van de experimentele periode, wassen wormen in 50 ml S. basale in 50 ml Falcon buis. Laat worm pellet te vormen door de zwaartekracht. Afzuiging supernatant tot ~ 5 ml blijft. Herhaal dit twee keer wassen meer in 50 ml van S. basale.
- Concentreer wormen ~ 1000 wormen / ml in 7 mL ronde bodem glazen buis. Voeg rubber stop en vacuum seal buis. Voeg 100 ul van 20% fosforzuur met een 1 ml spuit met een 25 gauge naald door de rubberen stop om opgelost worm CO 2 vrij te geven.
- Verwijder 2 mL sfeer en injecteer in 12 ml blue-top auto-sampler buizen pre-gevuld met helium voor opgeloste CO 2-meting.
- Analyseer "opgelost CO 2 monsters" door Gas-ratio massaspectrometer (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
Protocol D. Verwerking geneutraliseerd monsters van protocollen A en B voor aminozuren en organische zuren analyse door middel van gaschromatografie / massaspectrometrie.
- Bead Bereiding:
- Voeg 1 N HCl om zowel Ag 1 en Ag 50 kralen apart in 1L bekers.
- Roer elke kolf gedurende 30 minuten met een magneetroerder.
- Was kralen met gedeïoniseerd water 10 maal in totdat de pH van spoelwater zijn gelijk aan pH van het water.
- Column Bereiding:
- Plaats een katoenen stekker net boven het smalste deel van Pasteur pipet tip.
- Voeg laste kralen aan elk van twee kolommen per monster, het vullen van elk ongeveer een derde van de kolom hoogte. Gebruik AG1 kralen voor organisch zuur extractie. Gebruik AG50 kralen voor aminozuur extractie.
- Voorbeeld Verwerking:
- Voeg 500 ui van het monster op de kolom met geladen AG1 kralen. Niets is toegevoegd aan het monster (zie protocol A, stap # 19B), alvorens te AG1 kolom om organische zuren halen, als monster wordt al bij een neutrale pH.
- Voeg 1 ml 0,1 N HCL om de resterende monster voor toepassing ervan op de AG50 kolom om aminozuren te halen.
- Laat monsters volledig doorlopen kolommen.
- Was kolom met water 10 keer tot wassingen zijn neutraal (7-8 pH-bereik).
- Elueer kolommen in de frisse, gelabeld glas 4 mL monster flacons:
- Voor Organic Acid extractie, voeg 3 ml van 3 N HCl tot AG1 kolom. Dit maakt analyse van de isotoop verrijking in het totale aantal van gelabelde koolstof onder de 3-carbon soorten (lactaat), 4-carbon soorten (aspartaat, succinaat, malaat),5-koolstof-soorten (glutamaat), en 6-koolstof-soorten (citraat).
- Voor Aminozuur-extractie: voeg 3 ml van 4 N NH 4 OH tot AG50 kolom. Dit maakt analyse van de isotoop verrijking in het totale aantal van gelabelde koolstof onder de 3-carbon soorten (alanine) en 5-koolstof-soorten (glutamine).
- Het monster wordt flacons in Reacti-Vap III Verdamper 's nachts tot het droog is.
E. Sample Derivitization en Machine Instellingen voor Massaspectrometrie
Voeg 50 ul van acetonitril en 50 ul van n-methyl-nt-butyldimethylsilyl trifluoroacetamide (MTBSTFA) aan elk monster flacon. Deksel, meng en incubeer gedurende 30 minuten bij 60 ° C. Injecteer 1-2 ul per monster in gaschromatografie / massaspectrometer (GC / MS).
F. Analyse van de resultaten
- Kwantificering van aminozuur pieken. Kwantificering van elk aminozuur door HPLC-analyse wordt berekend met behulp van de oppervlakte van elke piek ten opzichte van die van de interne standaard.
- Het berekenen van isotopische verrijking. Stabiele isotopen verrijking wordt berekend in Excel (Microsoft) voor elke soort volgens de volgende formule: Atom Procent Excess, gecorrigeerd (APE) = (R sa-R st) * 100 / [(R sa-R st) +100], waarbij R sa - Ratio van het monster en R st - verhouding van de standaard.
- Het beoordelen van statistische verschillen tussen monster verrijking. Student's t-test wordt gebruikt om de betekenis van de relatieve aminozuur en isotopen label verschillen tussen de monsters te beoordelen.
Representatieve resultaten:
Stabiele isotoop is goed opgenomen in jong volwassen wormen, zoals blijkt uit gelabeld koolstof gemeten in de atmosferische CO 2 en opgelost worm CO 2. In wormen gevoed levende of UV-bestraalde gedood OP50 E. coli, de verhouding van 13 CO 2 12 CO 2 was groter in de opgeloste worm CO 2-fractie ten opzichte van de vrijgekomen atmosferische CO 2 (Figuur 1). Voeren wormen leven of gedood OP50 E. coli niet significant veranderde de gemeten 13 CO 2 12 CO 2-verhouding in gewassen worm extract (zie PROTOCOL C1).
Langdurige blootstelling aan stabiele isotopen uit de vroege larvale periode toegenomen isotopische verrijking in intermediaire metabolieten. Gecorrigeerd Atomen Procent Excess van gelabelde koolstof bepaald in intermediaire metabolieten van jonge volwassen wild-type wormen groter was in alle soorten glutamaat als wormen werden gevoed universeel-gelabeld 13 C-glucose en levende bacteriën tijdens de ontwikkeling ten opzichte van dezelfde behandelde dieren gelabeld bacteriën gevoed voor 48 uren pas na het bereiken van de leg volwassen stadium (figuur 2).
Effect van clearing malen op isotopische verrijking. Ongeacht de blootstelling tijdsverloop, waren alle dieren gekweekt op platen 'opgeruimd' van isotopen label voorafgaand aan de downstream voorbereiding voor GC / MS analyses. Vergelijking van de clearing-protocollen werd uitgevoerd zoals weergegeven in figuur 2, inclusief voeden wormen voor 2 uur op NGM agarplaten verspreid met live verse bacteriën zonder isotoop of voeden met NGM agarplaten zonder bacteriën gedurende 2 uur, en het voeden van NGM agarplaten zonder bacteriën voor 2 of 6 uur. Ongeacht isotopische blootstelling aan natuurlijk, was er geen significant verschil in de isotopische verrijking in intermediaire metabolieten van jonge volwassen hele worm extract waargenomen bij dieren werden geruimd op platen zonder bacteriën voor 2 of 6 uur. Daarentegen was minder isotopenverrijking waargenomen in intermediaire metabolieten wanneer dieren werden vervolgens 'opgeruimd' van overtollige isotopen door zich te voeden op de niet-gemerkte bacteriën voor twee uur. Echter, meer verrijking in +3, +4, en +5 soorten werd duidelijk toen wormen werden blootgesteld aan isotopen uit de vroege larvale periode. Daarom werd de optimale clearing-protocol bepaald op clearing wormen na hun incubatie op NGM borden verspreid met stabiele isotopen en bacteriën door latere incubatie gedurende 2 uur op unspread NGM platen. Opmerkelijk was, dat wormen gekweekt in vloeibare cultuur gewassen vrij van isotopische label en bacteriën in drie delen van S. basale (zie Protocol B); GC / MS analyse van spoelwater toonde geen significante isotopische verrijking door de derde te wassen.
Worm slijpen leverde maximale verrijking in intermediaire metabolieten. Voor het optimaliseren procent verrijking in intermediaire metabolieten volgende soortgelijke behandeling voorwaarden, de vergelijking werd gemaakt van de worm monsters verstoord door sonicatie alleen of sonicatie plus slijpen. Figuur 3 laat zien dat wormen verstoord na isotoop blootstelling door sonicatie plus malen had groter isotopenverrijking dan monsters verstoord alleen door sonicatie. Deze gegevens suggereren dat meer sub-organismale fracties werden verstoord door slijpen dan met het ultrasoonapparaat. Latere studies toonden alleen slijpen zonder sonication was voldoende om maximaal isotopenverrijking (gegevens niet getoond) te bereiken.
Hele worm isotopische blootstelling maakt analyse van de intermediaire metabole route flux. Voeden leven wormen met een stabiele isotoop voorloper zowel tijdens de ontwikkeling (PROTOCOL A, figuur 4A) of begin in volwassen stadium dieren (PROTOCOL B, Figuur 4B) maakt het mogelijk gevoelige analyse van de isotopische verrijking onder de metabolieten indicatief voor flux door glycolyse (lactaat, alanine), pyruvaat metabolisme (alanine), en de citroenzuur-cyclus (citraat, malaat, succinaat, aspartaat, glutamaat en glutamine). Universeel-gelabelde 13C-glucose biedt robuuste kenmerken van alle koolstof soorten, terwijl het gebruik van 1,6 - 13 C 2-glucose maakt robuuste etikettering alleen in +1 soorten van elk metaboliet. Deze techniek kan gevoelig onderscheiden verschillen ten opzichte van wild-type worm tussenpersoon metabole flux onder de mitochondriale ademhalingsketen mutante stammen, zoals het complex III mitochondriale ademhalingsketen subeenheid mutant isp-1 (qm150). Figuur 5 illustreert de omvang van de geconstateerde verschillen in absolute label tussen isp-1 (qm150) en N2 wormen elk blootgesteld gedurende 24 uur tot 1,6 - 13 C 2-glucose in vloeibare cultuur met K12 E. coli-bacteriën uit de eerste dag van de eileg jong volwassen stadium (Protocol B). Extra stabiele isotopen studies in een reeks van mitochondriale mutant wormen zijn aan de gang.
Figuur 1. Universeel-gelabelde 13C-glucose stabiele isotoop werd goed opgenomen in jong volwassen wormen 13 CO 2:. 12 CO 2-ratio (atomen procent overschot (APE), gecorrigeerd) in wild-type (N2) wormen volgende twee uur voeden universeel label 13 C-glucose en ofwel UV-gedood of OP50 bacteriën op platen (PROTOCOL C1) wonen. 13 C incorporatie in worm metabolieten werd robuuste na twee uur isotoop blootstelling. Blauwe en rode balken geven de relatieve isotopische verrijking in de gasfase ("atmosferische CO 2") en vloeibare fase ("worm CO 2"), respectievelijk.
Figuur 2. Langdurige blootstelling aan isotoop uit de vroege larvale periode en vervolgens 'clearing' wormen op NGM agarplaten zonder bacteriën toegenomen isotopische verrijking in de vrije glutamaat van jonge volwassen wormen. Isotopische verrijking in glutamaat soort is getoond voor wormen gevoed met NGM agar platen met universeel-gelabelde- 13 C-glucose en OP50 bacteriën ofwel tijdens de ontwikkeling van de L1 larvale stadium door middel van de 959 cellen jong volwassen stadium ("L1", zie PROTOCOL A), of voor achtenveertig uur vanaf het moment dat wormen de eerste dag van de bereikte eierleggende jonge volwassen stadium ("YA"). X-as geeft het totale aantal van gelabelde koolstofatomen in elke glutamaat soort. Y-as geeft het percentage verrijking (gecorrigeerd atomen per overschot (APE)). Groene balken geven de wormen goedgekeurd na isotoop blootstelling door het voeren van OP50 E. coli zonder isotoop op NGM platen gedurende twee uur voorafgaand aan de PCA extractie. Blauw en grijs balken geven de wormen goedgekeurd na isotoop blootstelling op NGM platen zonder bacteriën of isotoop voor twee of zes uur respectievelijk, voorafgaand aan de PCA extractie.
Figuur 3. Verstoren van wormen door slijpen levert maximale isotopische verrijking in intermediaire worm metabolieten. Procent van de koolstof verrijking gemeten in +1 citraat soorten in wild-type wormen behandeld gedurende 24 uur in vloeibare cultuur met 1,6 - 13 C 2-glucose zonder bacteriën (PROTOCOL B). Zwarte en grijze balken geven aan wormen die werden verstoord door sonicatie alleen of met het ultrasoonapparaat en slijpen respectievelijk. Isotopische verrijking na blootstelling aan 1,6 - 13 C 2-glucose wordt het best beoordeeld in metabolieten aangegeven op een koolstof. In tegenstelling, is het etiket verrijkt met alle soorten van elke metaboliet als universeel-gelabeld-13 C-glucose wordt gebruikt.
Figuur 4. Representatieve resultaten illustreren de omvang van de isotopische verrijking in worm intermediaire metabolieten indicatief voor flux door glycolyse, pyruvaat metabolisme en de citroenzuur-cyclus. Gecorrigeerd atomen procent overschot (APE) werd bepaald bij jonge volwassen wild-type (N2 Bristol) wormen na een, 6 tot 13 C 2-glucose blootstelling aan ofwel (A) tijdens de ontwikkeling van L1 podium op borden (PROTOCOL A), of (B) vanaf de eerste dag van de eileg als jonge volwassenen voor 24 uur in vloeibare cultuur (PROTOCOL B) . Foutbalken geven de standaarddeviatie waar betrouwbare isotopen gegevens van drie biologische repliceert beschikbaar was.
Figuur 5. Absolute aminozuur kwantificatie van het aminozuur metaboliet soorten in wild-type en mutant mitochondriale worm stammen. Absolute label in elke soort van vier aminozuren werd berekend door vermenigvuldiging van HPLC-bepaalde vrije aminozuren concentratie (nmol / mg worm eiwit) door gerectificeerd atomen procent overschot (APE) voor elke soort. Grijs en zwart balken geven de wild-type (N2 Bristol) en mitochondriale complex III subeenheid mutante stammen (isp-1 (qm150)), respectievelijk. Balken geven gemiddeld drie biologische experimenten te repliceren per stam.
Discussion
Toepassing van massaspectrometrie voor abundantie te meten in intermediaire metabolieten biedt een prachtig gedetailleerd beeld van de kritische biochemische veranderingen 5. Hier hebben we gedetailleerde protocollen voor de exploitatie van deze zeer gevoelige en specifieke methode voor de tussenpersoon metabole flux beoordelen in het genetisch veelzijdige model van, C. elegans. Sterker nog, voeding levende dieren met een stabiele isotoop gemerkte metabole precursors (zoals 13 C-glucose) maakt nieuwe inzicht in de intermediair metabole route flux bij het meten van isotopische verrijking in downstream metabolieten. We hebben betrouwbare methode om robuuste analyse van de flux te verkrijgen door middel van glycolyse, pyruvaat metabolisme en de citroenzuur-cyclus. Dit kan worden bereikt, zowel in dieren gevoed met stabiele isotopen vanaf de vroege larvale ontwikkelingsstadia of aan het begin in de post-mitotische volwassen periode. Isotopische verrijking in verschillende metaboliet soorten kunnen bestudeerd worden in combinatie met hele worm vrije aminozuren profilering van high performance liquid chromatografie, zoals eerder beschreven vier, de absolute isotopische verrijking te bepalen in verschillende soorten van vrije worm alanine, aspartaat, glutamaat en glutamine. Inderdaad, zijn consistent patroon van isotopische verrijking verkregen bij het meten van aminozuren en organische zuren analyten in hoeveelheden van 1.000 tot 2.000 jong volwassene synchroon wormen. Een dergelijke methode kan abnormale intermediair flux gevoelig discrimineren in de nucleaire gen-gebaseerde mitochondriale mutante stammen in vergelijking met wild-type wormen.
Deze techniek houdt waarde flux veranderingen te onderzoeken in specifieke biochemische pathways van belang om gemeenschappelijke aangeboren stofwisselingsziekten. In het bijzonder het gebruik van glucose gelabeld met een stabiele isotoop koolstof informeert flux door de centrale metabolische wegen die van belang zijn mitochondriale ziekte. Inderdaad, onze gegevens suggereren toepassing van deze methode kan gevoelig abnormale intermediair flux discrimineren op een nucleair gen-gebaseerde mitochondriale complex III subeenheid mutante stam (isp-1 (qm150)) ten opzichte van wild-type wormen.
Het is belangrijk te erkennen dat, omdat blootstelling aan isotopen is voltooid over een periode van een tot enkele dagen, gekwantificeerd isotopische verrijking is een "steady state" verrijking waarde in plaats van meetbare flux gedurende een bepaalde periode als zou kunnen worden bepaald in cel-gebaseerde modellen blootgesteld aan isotoop voor een periode van minuten tot uren. Een andere mogelijke beperking van ondervragen pad flux in de loop van de nematode ontwikkeling heeft betrekking op verschillende lengtes van larvale ontwikkeling die zich voordoen in het bijzonder mutante stammen. Bijvoorbeeld, zijn vele ernstige mitochondriale mutaties bekend te arresteren veroorzaken op de derde (L3) larvale stadium 6. Zo kan de analyse van isotopen incorporatie alleen bij dieren die overleven tot volwassen leeftijd niet representatief voor de gehele bevolking mutant. Zou echter kunnen deze methodiek worden aangepast aan isotoop opname te beoordelen in intermediaire metabolieten op een bepaalde larvale stadium (zoals L2) in plaats van te wachten voor de dieren om het volwassen stadium te bereiken. Zo hebben dieren die het alternatieve larvale stadium bekend als Dauer waarschijnlijk gaan significant veranderd (waarschijnlijk lager) metabole flux ten opzichte van dieren die direct doorgaan door de vier larvale stadia. Toekomstig onderzoek kan ook worden uitgevoerd om isotoop opname rechtstreeks te beoordelen in Dauer stadium dieren van verschillende genetische achtergronden. Blootstellen van dieren stabiele isotoop voor een vaste periode (hier 24 tot 48 uur) begint zodra dieren bereikte de jonge volwassen stadium (zoals beschreven in Protocol B) wordt het effect van de variabele ontwikkeling periodes. Terwijl de 13 C-glucose alleen ondervraagt glycolyse, pyruvaat metabolisme en tricarbonzuur cyclus flux, kunnen andere isotopen tracers mogelijk worden beoordeeld om biochemische route flux ondervragen via andere routes van interesse in nematoden. Bijvoorbeeld, 15 N-glycine worden gebruikt om aminozuur omzet in nematoden te beoordelen.
Een andere mogelijke beperking van deze aanpak is het niveau van de gevoeligheid van de metaboliet detectie. Onze ervaring suggereert een minimum van 500 jonge volwassen aaltjes nodig zijn om isotopen integratie succesvol te kwantificeren door de HPLC en GC / MS-methoden hier werkzaam. Gebruik van instrumenten met een grotere gevoeligheid, zoals de ultra performance vloeistofchromatografie (UPLC), toestaan dat verdere verlaging van de onderzochte dier-nummer, ook al verwachten we dit waarschijnlijk om een betrouwbare kwantificering van metabolieten en isotopische integratie mogelijk te maken in de metaboliet soorten uit enkele wormen. We bestudeerden worm populaties van 1.000 dieren per experiment, dat vonden we om een betrouwbare lage abundantie metabolieten te detecteren in elke stam. Echter, sommige metabolieten, zoals GABA, alleen betrouwbaar worden gekwantificeerd in veel grotere populaties van nematoden, in de orde van1x10 6 dieren 4.
Samengevat, stabiele isotoop profilering zorgt voor een niet-invasieve en veilige (niet-radioactief) benadering die al lang gebruikt om aangeboren stofwisselingsziekten te bestuderen. De toepassing van deze methodologie op C. elegans biedt de nieuwe capaciteit te onderzoeken in vivo, real-time, metabole veranderingen die zich voordoen op het gehele dier niveau, dat kan het gevolg zijn van individuele genetische aandoeningen en / of farmacologisch middel blootstelling.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd deels gefinancierd door de National Institutes of Health (K08-DK073545 en NICHD gesponsorde verstandelijke beperking Research Center New Investigator Award), The Philadelphia Foundation, en de Universiteit van Pennsylvania McCabe award (MJF), evenals de Tristan Mullen Fonds (MJF en MY). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S. basal | 1 - page 59 | Protocols A and B | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-8503 | Protocol B |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | Protocols A and C | |
| K12 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | Protocol B | |
| NGM agar | Research Products International Corp. | N81800-1000.0 | Protocols A, B, and C |
| 13C glucose (universally labeled) | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396 | Protocol A and C |
| 13C glucose (1,6 labeled) | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-2717 | Protocol B |
| 60% Perchloric acid (PCA) | Fisher Scientific | MK2766500 | Protocols A and B |
| ε-aminocaproic acid (Internal Standard) | Sigma-Aldrich | A-2504 | Protocols A and B |
| MTBSTFA | Regis | 270243 | Protocol E |
| Acetonitrile | Regis | 270010 | Protocol E |
| AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin | Bio-Rad | 140-1441 | Protocols A and B (organic acid extraction) |
| AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin | Bio-Rad | 142-1441 | Protocols A and B (amino acid extraction) |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | Protocol C |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | Protocol C |
| 3N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Protocol D |
| 1N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Protocol A |
| 0.1 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Protocol D |
| 4N NH4OH | Sigma-Aldrich | 30501 | Protocol D |
| 4N KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Protocols A and B |
| Deionized water | Milli Q Biocel | ZMQA60F01 | Protocol D |
| Helium | Airgas | 24001364 | Protocol C2 |
| SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope | Nikon Instruments | NI MNA41000 | Protocols A, B, and C |
| pH meter | Fisher Scientific | S68167 | Protocols A and B |
| Table top centrifuge - 5804R | Eppendorf | 05-400-93 | Protocols A and B |
| Incubated platform shaker | New Brunswick Scientific | M1324-0004 | Protocol B |
| Mini LabRoller Rotator | Labnet International | H-5500 | Protocols A and B |
| Pestles | Kontes Corp | K749520-0090 | Protocols A and B |
| Drill | Kontes Corp | K749540-0000 | Protocols A and B |
| 1 L glass beaker | Fisher Scientific | 02-539P | |
| 1 L Erlenmeyer Flasks | VWR international | 89000-368 | |
| 25 mL Erlenmeyer Flasks | VWR international | 89000-356 | Protocol B |
| 7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper | VWR international | VT6431 | Protocols A, B, and C1,C2 |
| 10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper | VWR international | VT6430 | Protocol C2 |
| Blue top tubes | Labco | 438B | |
| 50 ml conical plastic tubes | Falcon BD | 14-959-49A | All protocols |
| 1.5 ml microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Protocols A and B |
| Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL) | BD Biosciences | 301025, 301029, 301031 | Protocols C1 and C2 |
| 25 gauge needles | Fisher Scientific | 22-253-131 | Protocols C1 and C2 |
| Poly-Prep Chromatography Columns | Bio-Rad | 731-1550 | Protocol D |
| Pasteur pipettes | VWR international | 14673-043 | Protocol D |
| 60mm Petri dishes | VWR international | 25373-085 | Protocol C |
| Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock | Custom Made | Protocol C | |
| Optically transparent glass plate | Custom Made | Protocol C | |
| Reacti-Vap III Evaporator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 18826 | Protocol D |
| Cotton | VWR international | 14224-516 | Protocol D |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | 1597418 | Protocol C1 |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-18 | Protocol B |
| Timer | ISC Bioexpress | T-2504-5 | Protocol C |
| Gas-Ratio Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Protocol D | |
| GC-MS | Hewlett-Packard | 5980/5971 | Protocol D |
| GC-MS | Agilent Technologies | 6980N/5973N | Protocol D |
| HPLC | Varian Inc., Agilent | 9010 | Protocol D |
References
- Hope, I. A. C. elegans: A practical approach. , University Press. Oxford. (1999).
- Dingley, S. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).
- Jones, B. N., Gilligan, J. P. o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids. Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).
- Falk, M. J. Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans. Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).
- Yudkoff, M. Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes. Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).
- Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span. J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).
