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Biology

विकास और वयस्क स्टेज में स्थिर माध्यमिक मेटाबोलिक फ्लक्स के समस्थानिक रूपरेखा Caenorhabditis एलिगेंस Published: February 27, 2011 doi: 10.3791/2288
Automatic Translation
1,2, *1, *1, 1, 1, 1,2
1Department of Pediatrics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

मध्यस्थ चयापचय प्रवाह की गैस क्रोमैटोग्राफी जन spectrometric विश्लेषण से स्थिर समस्थानिक रूपरेखा निमेटोड में वर्णित है,

Abstract

स्थिर समस्थानिक रूपरेखा लंबे समय आनुवंशिक परिवर्तन और / या सेलुलर और स्तनधारी मॉडल में pharmacologic उपचार के चयापचय परिणामों के प्रति संवेदनशील जांच की अनुमति दी है. यहाँ, हम विस्तृत निमेटोड, Caenorhabditis एलिगेंस में मध्यस्थ चयापचय और चयापचय प्रवाह स्थिर समस्थानिक रूपरेखा प्रदर्शन विधियों का वर्णन. तरीके स्थिर आइसोटोप या तो प्रारंभिक विकास से निमेटोड विकास मीडिया अगर या युवा वयस्कों के रूप में प्लेटें शुरुआत पर उजागर करते हुए विभिन्न pharmacologic उपचार के लिए संपर्क में पशुओं में पूरे कृमि मुक्त अमीनो एसिड, कार्बन डाइऑक्साइड लेबल, लेबल कार्बनिक अम्ल, और लेबल एमिनो एसिड की रूपरेखा के लिए में वर्णित हैं तरल संस्कृति में. मुफ्त एमिनो एसिड पूरे कीड़ा 4% perchloric एसिड में निकाले aliquots में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. वैश्विक 13 सी ग्लूकोज या 1,6 लेबल - 13 सी 2 शर्करा स्थिर समस्थानिक अग्रदूत लेबल जिसका कार्बन कार्बन डाइऑक्साइड में मास स्पेक्ट्रोमेट्री (वायुमंडलीय और भंग दोनों) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से प्रवाह के संकेत चयापचयों द्वारा पता लगाया है के रूप में उपयोग किया जाता है पाइरूवेट चयापचय, और tricarboxylic एसिड चक्र. प्रतिनिधि परिणाम जंगली प्रकार नेमाटोड में आइसोटोप जोखिम समय के प्रभाव, विभिन्न जीवाणु समाशोधन प्रोटोकॉल है, और वैकल्पिक कीड़ा व्यवधान तरीकों का प्रदर्शन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में mitochondrial जटिल III उत्परिवर्ती कीड़े में समस्थानिक निगमन के रिश्तेदार हद तक (आईएसपी 1 (qm150 शामिल हैं) ) जंगली प्रकार के कीड़े के लिए सापेक्ष. रहने वाले नेमाटोड में स्थिर समस्थानिक प्रोफाइलिंग की आवेदन पूरे जानवर स्तर वास्तविक समय चयापचय परिवर्तन है कि व्यक्तिगत आनुवंशिक विकारों और / या pharmacologic चिकित्सा की वजह से कर रहे हैं पर जांच करने के लिए एक उपन्यास क्षमता प्रदान करता है.

Protocol

प्रोटोकॉल एक सी. के दौरान स्थिर मध्यस्थ चयापचय के समस्थानिक रूपरेखा: एन जी एम प्लेटों पर एलिगेंस विकास.

* नोट: स्थिर आइसोटोप सफलतापूर्वक संवर्धन आइसोटोप जोखिम (या तो सार्वभौमिक लेबल 13 सी ग्लूकोज या 1,6 के साथ - 13 सी 2 ग्लूकोज) के बाद किया जा सकता है युवा वयस्क निमेटोड आबादी में मापा प्रारंभिक विकास में या जल्दी वयस्कता में या तो शुरुआत है. इस प्रोटोकॉल पशु स्वास्थ्य, विकास, और मानक निमेटोड वृद्धि मीडिया (एन जी एम) प्लेटें, जो के रूप में तरल संस्कृति में आसानी से नहीं हासिल की है पर विकास की समवर्ती निगरानी की सुविधा.

  1. निमेटोड विकास मीडिया के 10 एमएल (एन जी एम) के साथ 100 मिमी पेट्री डिश तैयार मानक तकनीक प्रति 1 .
  2. OP50 ई. के साथ फैले एन जी एम प्लेटें 1 कोलाई और रातोंरात सूखे की अनुमति देते हैं .
  3. - 13 सी 2 (एन जी एम थाली पर एक 10 मिमी के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के) ग्लूकोज थाली करने के लिए समान रूप से 200 1,6 मिमी की 500 μL जोड़ें. रातोंरात सूखे की अनुमति दें.
  4. ब्लीच gravid वयस्क कीड़े 1. 13 सी 2 ग्लूकोज - प्लेट एन जी एम प्लेटों पर बैक्टीरिया या 1,6 के बिना अंडे बरामद . 20 में डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं.
  5. 13 - सी 2 ग्लूकोज और OP50 ई. अगले दिन, रची, एन जी एम पहले 1,6 के साथ फैल प्लेटों पर लार्वा L1-गिरफ्तार हस्तांतरण कोली (प्रति कदम # 2, ऊपर). युवा वयस्क चरण (48-72 घंटे, तनाव के आधार पर) के लिए कीड़े आगे बढ़ें, देखभाल कीड़े भूखा नहीं है.
  6. एस बेसल के 3-4 एमएल के साथ प्लेटों से तुल्यकालिक, प्रथम दिन युवा वयस्क कीड़े लीजिए.
  7. 50 एमएल फाल्कन ट्यूबों में एस बेसल के 50 एमएल में कीड़े धो लें. गोली के लिए 5 मिनट के लिए गंभीरता से कीड़े की अनुमति दें. ~~ 5 एमएल सतह पर तैरनेवाला निकालें. दोहराएँ दो बार धोने.
  8. तीन 100 μL 2 aliquots गिनती द्वारा कीड़ा संख्या अनुमान. 1000 कीड़े / एस बेसल के एमएल कीड़ा एकाग्रता समायोजित करें.
  9. पिपेट 1 एक 1.5 एमएल प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में एमएल (1000 कीड़े).
  10. 60% 4% पीसीए और आंतरिक मानक के 200 μmol के अंतिम एकाग्रता के लिए आंतरिक मानक (ε - aminocaproic एसिड) युक्त पीसीए के 69 μL जोड़ें.
  11. चलो कीड़े गुरुत्व एक्स 5 मिनट द्वारा व्यवस्थित. निकालें और एक और ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला बचाने के लिए.
  12. कीड़ा नमूने 15 सेकंड के लिए प्लास्टिक (Kontes गोली मूसल) homogenizer और motorized ड्रिल (Kontes गोली मूसल ताररहित मोटर) का उपयोग कर पीस. दिखने में प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कीड़ा व्यवधान की पुष्टि करें. दोहराएँ यदि आवश्यक हो.
  13. कदम # 11 # 12 कदम से homogenate के साथ गठबंधन से सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण.
  14. 5 मिनट के लिए 2250 rpm (1300 XG) में नमूना अपकेंद्रित्र.
  15. ताजा 7 एमएल ग्लास ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. प्रोटीन एकाग्रता परख के लिए गोली नीचे के रूप में # 20 कदम में विस्तृत सहेजें,.
  16. 7-8 (तटस्थ) 4N KOH रेंज का उपयोग कर पीएच नमूने.
  17. 7 एमएल ग्लास ट्यूब में 5 से लवण हटायें मिनट के लिए 2250 rpm (1300 XG) में neutralized नमूने अपकेंद्रित्र.
  18. ताजा 7 एमएल ग्लास ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण.
  19. Metabolite quantitation के लिए निष्प्रभावी नमूने द्वारा तैयार:
    1. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC): HPLC में प्रत्यक्ष इंजेक्शन के लिए neutralized नमूना के अलग 50 μL. मुफ्त एमिनो एसिड quantitation HPLC (Varian) O-phthalaldehyde और फ्लोरोसेंट का पता लगाने के साथ पूर्व स्तंभ derivatization का उपयोग कर के रूप में पहले 3-4 वर्णित द्वारा किया जाता है.
    2. गैस क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी / एमएस): शेष निष्प्रभावी नमूने, एमिनो एसिड और कार्बनिक अम्ल में जीसी / एमएस समस्थानिक संवर्धन के निर्धारण के लिए आयन एक्सचेंज राल (जैव रेड) का उपयोग कर के रूप में प्रोटोकोल डी. में विस्तृत की निकासी के साथ आगे बढ़ें
  20. शेष प्रोटीन गोली 7 एमएल ग्लास ट्यूब में 1N NaOH के 1 एमएल जोड़ें (# 15 कदम से).
  21. सेते कमरे के तापमान पर प्रोटीन नमूना NaOH जबकि घूर्णन रातोंरात (Labnet * LabRoller अंग को घुमानेवाली पेशी) का इलाज जब तक भंग.
  22. NaOH इलाज प्रोटीन की 75-100 μL का उपयोग करने के लिए मानक तरीकों (डीसी प्रोटीन परख, जैव रेड) द्वारा प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण.

सी. में प्रोटोकॉल बी स्थिर मध्यस्थ चयापचय के समस्थानिक रूपरेखा एलिगेंस तरल संस्कृति में युवा वयस्कों.

* नोट: या तो एन जी एम प्लेटों पर बिछाने अंडे के पहले दिन पर समस्थानिक जोखिम शुरुआत के बाद वयस्क नेमाटोड में मध्यस्थ चयापचय प्रवाह पर Pharmacologic प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है (देखने के एक प्रोटोकॉल, ऊपर) या तरल संस्कृति में. हम बाद के लिए स्थिर आइसोटोप और pharmacologic एजेंट उपयोग की लागत दक्षता को अधिकतम करने के दृष्टिकोण पसंद करते हैं.

  1. पतला तुल्यकालिक, पहले दिन अंडे बिछाने बेसल एस 500 μL प्रति 2000 पशुओं को .०००५% (बेसल एस के 1L 1% कोलेस्ट्रॉल के 0.5 एमएल (95% इथेनॉल में भंग) जोड़ने के द्वारा प्राप्त) कोलेस्ट्रॉल युक्त में युवा वयस्कों.
  2. 25 एमएल Erlenmeyer बोतल में ~ 4 एमएल कुल मात्रा संस्कृति (ओं) का सेट, के रूप में इस प्रकार है:
    उपचार: कोई नहीं "दवा"
    कोलेस्ट्रॉल के साथ एस बेसल 3020 μL 3020 उल - "औषध" मात्रा
    स्थिर आइसोटोप (1,6 - 13 सी 2 - ग्लूकोज) 80 μL 80 μL
    K12 ई. कोली (660 आयुध डिपो 2.5 से 3) 400 μL 400 μL
    युवा वयस्क कीड़े (2,000) 500 μL 500 μL
    ड्रग ए (वांछित एकाग्रता) - के रूप में वांछित
  3. कवर पन्नी के साथ बोतल. 220 rpm पर 20 डिग्री सेल्सियस incubated मंच प्रकार के बरतन में 24 घंटे के लिए बोतल को हिलाएँ.
  4. सुनिश्चित करें कि बोतल पूरी तरह से बंद नहीं कर रहे हैं के रूप में ऑक्सीजन मध्यस्थ चयापचय प्रवाह के लिए और अंतर्जात निमेटोड चयापचयों की लेबलिंग परिणामस्वरूप के लिए आवश्यक है.
  5. एक 50 एमएल शंक्वाकार प्लास्टिक ट्यूब में एस बेसल के 46 एमएल 4 एमएल संस्कृति मात्रा जोड़कर कीड़े धो लें. गोली के लिए 5 मिनट के लिए गंभीरता से कीड़े की अनुमति दें. नीचे ~ 5 एमएल बनी हुई सतह पर तैरनेवाला वैक्यूम चूषण. ट्यूब से अधिक दो बार एस बेसल के साथ 50 एमएल refilling के द्वारा धो दोहराएँ.
  6. 1000 एक 1.5 एमएल प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में कीड़े / एमएल धोया कीड़े ध्यान लगाओ.
  7. 200 μmol आंतरिक मानक के अंतिम एकाग्रता और 4% पीसीए को प्राप्त करने के 60% perchloric एसिड (पीसीए) के 69 μL और 10 आंतरिक मानक (ε - aminocaproic एसिड) सुक्ष्ममापी 2 μL जोड़ें.
  8. प्रति कदम के रूप में नमूने तैयार # 11-22 प्रोटोकोल ए में

प्रोटोकोल C-1. वातावरण और भंग कार्बन डाइऑक्साइड में लेबल कार्बन अनुरेखण द्वारा प्लेटों पर वयस्क कीड़े में समस्थानिक उपयोग की निगरानी करना.

* नोट: प्रोटोकॉल जबकि ए और बी विस्तार तरीकों मुक्त चयापचयों में आइसोटोप समावेश पर नजर रखने के लिए कीड़े के भीतर या वयस्क जीवन के विकास और 1 दिन के 2-3 दिनों के से अधिक, क्रमशः, एक कम समय के पाठ्यक्रम पर सफलता और समस्थानिक निगमन के कैनेटीक्स के सकल पुष्टि (यानी, घंटे मिनट) वायुमंडलीय कार्बन डाइऑक्साइड में निगरानी लेबल के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है (सीओ 2) कीड़े से जारी या कीड़ा निकालने के भीतर भंग कार्बन डाइऑक्साइड में निहित है. लाइव या मारे जीवाणु कीड़े को खिलाया जा सकता है जब प्लेटें (सी -1 प्रोटोकोल) पर हो. जीवाणु कीड़े के तरल संस्कृति में अल्पकालिक आइसोटोप जोखिम (प्रोटोकोल सी 2) के लिए आवश्यक नहीं है.

  1. एन जी एम अगर के 10 एमएल के साथ 100 मिमी पेट्री डिश तैयार करें. या तो जीना या यूवी मारे OP50 ई. के साथ एन जी एम प्लेटें बिखरा हुआ कोली (के रूप में चित्रा 1 में प्रदर्शन ). प्लेटें रातोंरात सूखे की अनुमति दें.
  2. 200 मिमी की 500 μL जोड़ें 1,6 लेबल-13 सी 2 OP50 प्रसार एन जी एम प्लेटें (एन जी एम प्लेट पर 10 मिमी की अंतिम आइसोटोप एकाग्रता के लिए) के लिए ग्लूकोज. प्लेटें रातोंरात सूखे की अनुमति दें.
  3. प्राप्त पहले दिन तुल्यकालिक, अंडे बिछाने, युवा वयस्क कीड़े एन जी एम अगर प्लेट पर हो OP50 ई. के साथ ही फैल कोलाई.
  4. प्रयोगात्मक एन जी एम अगर प्लेटें स्थिर आइसोटोप और ई. युक्त 1000 युवा वयस्क कीड़े स्थानांतरण कोली (प्रति 1-2 कदम, ऊपर के रूप में तैयार ).
  5. जगह अच्छी तरह से सील तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी के साथ फिट करने के लिए सटीक माहौल नमूने और प्रतिस्थापन के लिए अनुमति देने के लिए कस्टम गिलास कक्ष में प्रयोगात्मक एन जी एम प्लेट कवर () के बिना. तुरंत ऑप्टिकली पारदर्शी कांच डिस्क के साथ कक्षों को सील. सीवन कवर जहां कांच डिस्क उच्च वैक्यूम तेल के साथ प्लेट पर बैठता है मुहर. "टाइम 0" के रूप में रिकॉर्ड समय.
  6. नमूना 30, 60, 90, और 120 मिनट पर 3 तरह एक 20 एमएल सिरिंज के साथ पानी निकलने की टोंटी द्वारा कांच के कक्ष से वातावरण के 10 एमएल. एक पूर्व तैयार 10 एमएल रबर डाट प्रत्येक वायुमंडलीय नमूना स्थानांतरण गिलास 0.1 एन NaOH में 1 1 मिमी NaHCO 3 एमएल है कि वैक्यूम किया गया है सील युक्त ट्यूब में सबसे ऊपर है.
  7. 3 तरह पानी निकलने की टोंटी एक 20 एमएल सिरिंज का उपयोग कर के माध्यम से प्रत्येक गिलास चेंबर में हवा पीठ के 10 एमएल इंजेक्षन. चैम्बर के लिए नमूना / reinjecting वातावरण के बाद और संग्रह समय अंक के बीच ऊष्मायन शुरू करने से पहले पानी निकलने की टोंटी बंद करें.
  8. 10 एमएल रबड़ डाट में डाट के माध्यम से 20% फॉस्फोरिक एसिड के 100 μL इंजेक्षन कांच वायुमंडलीय CO 2 नमूना युक्त ट्यूब में सबसे ऊपर है.
  9. वातावरण की 2 एमएल निकालें और यह 12 एमएल नीले शीर्ष ऑटो पारखी वायुमंडलीय सीओ 2 माप के लिए हीलियम के साथ पहले से भरे ट्यूब में इंजेक्षन .
  10. गैस अनुपात मास स्पेक्ट्रोमीटर (ThermoQuest Finnigan डेल्टा प्लस) द्वारा विश्लेषण "वायुमंडलीय CO 2 नमूने".
  11. दो घंटे आइसोटोप ऊष्मायन और सभी वायुमंडलीय नमूनों की अवधि के संग्रह के बाद ओपन कांच कक्षों.
  12. कीड़े एन जी एम एस बेसल के 3 एमएल का उपयोग प्लेटों के बंद धो लें.
  13. 50 एमएल फाल्कन ट्यूबों में 50 एमएल एस बेसल में कीड़े धो लें. धोने दो बार दोहराएँ.
  14. 1000 ~ 7 एमएल गिलास दौर नीचे ट्यूब (ओं) में कीड़े / एमएल कीड़े ध्यान लगाओ.
  15. रबड़ डाट के साथ वैक्यूम सील ग्लास ट्यूब.
  16. 100 μL जोड़ेंसीओ 2 भंग रिहाई सिरिंज के साथ रबड़ डाट के माध्यम से 20% फॉस्फोरिक एसिड के.
  17. वातावरण के 2 एमएल निकालें और 12 एमएल नीले शीर्ष ऑटो पारखी भंग सीओ 2 माप के लिए हीलियम के साथ पहले से भरे ट्यूब में इंजेक्षन .
  18. गैस अनुपात मास स्पेक्ट्रोमीटर (ThermoQuest Finnigan डेल्टा प्लस) द्वारा विश्लेषण "भंग सीओ 2 नमूने".

वैकल्पिक प्रोटोकॉल (सी -2): वातावरण और भंग कार्बन डाइऑक्साइड में लेबल कार्बन अनुरेखण द्वारा निरीक्षण तरल संस्कृति में वयस्क कीड़े में समस्थानिक उपयोग.

  1. तुल्यकालिक, पहले दिन अंडे बिछाने, युवा वयस्क एन जी एम अगर OP50 ई. के साथ फैल प्लेटों पर बड़े कीड़े प्राप्त करने कोलाई.
  2. 50 एमएल फाल्कन ट्यूबों में एस बेसल के 50 एमएल में कीड़े धो लें. गोली के लिए 5 मिनट के लिए गंभीरता से कीड़े की अनुमति दें. ~~ 5 एमएल सतह पर तैरनेवाला निकालें. दोहराएँ दो बार अधिक washes.
  3. 1 एमएल एस बेसल में 10 एमएल गिलास दौर नीचे ट्यूब 1000 युवा वयस्क कीड़े स्थानांतरण. 1 13 सी ग्लूकोज कीड़े के 1 एमएल 10 मिमी के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के सार्वभौमिक लेबल एम शेयर 10.1 μl जोड़ें.
  4. आक्सीजन के साथ मिलना गिलास दौर नीचे खुले ट्यूब में 2 मिनट के लिए 100% ऑक्सीजन बहने के साथ माहौल का आदान प्रदान करके कीड़े और आइसोटोप युक्त ट्यूब. रबड़ डाट के साथ तुरंत ट्यूब बंद.
  5. 220 rpm पर 20 डिग्री सेल्सियस incubated मंच प्रकार के बरतन में प्रयोगात्मक ट्यूबों हिलाएँ. "टाइम 0" के रूप में समय शुरू कीर्तिमान.
  6. नमूना 10 एमएल गिलास दौर नीचे रबड़ डाट के माध्यम से 30, 60, 90, और 120 मिनट पर एक 10 एमएल सिरिंज और 25 गेज सुई का उपयोग कर ट्यूब से 5 वातावरण की एमएल.
  7. एक पूर्व तैयार, रबड़ डाट प्रत्येक वायुमंडलीय नमूना स्थानांतरण 10 एमएल गिलास 0.1 एन NaOH में 1 1 मिमी 3 NaHCO के एमएल है कि वैक्यूम किया गया है सील युक्त ट्यूब में सबसे ऊपर है.
  8. प्रत्येक प्रयोगात्मक दौर नीचे कांच रबर डाट एक 10 एमएल सिरिंज और 25 गेज सुई का उपयोग कर के माध्यम से कीड़े और आइसोटोप युक्त ट्यूब में हवा पीठ के 5 एमएल इंजेक्षन.
  9. प्रयोगात्मक 10 एमएल दौर नीचे कांच संग्रह समय अंक के बीच 220 rpm पर झटकों से कीड़े और आइसोटोप युक्त ट्यूबों के ऊष्मायन जारी रखें.
  10. डाट के माध्यम से रबर डाट युक्त वातावरण में 20% फॉस्फोरिक एसिड के 100 μL इंजेक्षन 10 एमएल ग्लास ट्यूब में सबसे ऊपर है.
  11. वातावरण के 2 एमएल निकालें और 12 एमएल नीले शीर्ष ऑटो पारखी वायुमंडलीय सीओ 2 माप के लिए हीलियम के साथ पहले से भरे ट्यूब में इंजेक्षन .
  12. गैस अनुपात मास स्पेक्ट्रोमीटर (ThermoQuest Finnigan डेल्टा प्लस) द्वारा विश्लेषण "वायुमंडलीय CO 2 नमूने".
  13. प्रयोगात्मक अवधि के अंत में, 50 एमएल फाल्कन ट्यूब में 50 एमएल एस बेसल में कीड़े धो लो. कीड़ा गोली गंभीरता से फार्म करने के लिए अनुमति दें. नीचे ~ 5 एमएल बनी हुई सतह पर तैरनेवाला वैक्यूम चूषण. एस बेसल के 50 एमएल में दो बार अधिक से धो दोहराएँ.
  14. 1000 ~ 7 एमएल गिलास दौर नीचे ट्यूब में कीड़े / एमएल कीड़े ध्यान लगाओ. रबड़ डाट और वैक्यूम मुहर ट्यूब जोड़ें. 20% फॉस्फोरिक एसिड रबड़ डाट के माध्यम से एक 25 गेज सुई के साथ एक 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करने के लिए भंग कीड़ा सीओ 2 रिलीज के 100 μL जोड़ें.
  15. 2 एमएल माहौल निकालें और 12 एमएल नीले शीर्ष ऑटो पारखी भंग सीओ 2 माप के लिए हीलियम के साथ पहले से भरे ट्यूब में इंजेक्षन .
  16. गैस अनुपात मास स्पेक्ट्रोमीटर (ThermoQuest Finnigan डेल्टा प्लस) द्वारा विश्लेषण "भंग सीओ 2 नमूने".

प्रोटोकॉल डी. प्रसंस्करण एमिनो एसिड और कार्बनिक अम्ल गैस स्पेक्ट्रोमेट्री / क्रोमैटोग्राफी जन द्वारा विश्लेषण के लिए ए और बी प्रोटोकॉल से निष्प्रभावी नमूने.

  1. मनका तैयारी:
    1. दोनों 1 एजी और एजी 1L beakers में 50 अलग - अलग मोती 1 एन एचसीएल जोड़ें.
    2. चुंबकीय उत्तेजक के साथ 30 मिनट के लिए प्रत्येक फ्लास्क हिलाओ.
    3. विआयनीकृत जल के साथ मोती धो 10 बार धोने का पीएच तक पानी का पीएच के बराबर हैं.
  2. स्तंभ तैयार:
    1. पाश्चर विंदुक टिप के सबसेसंकरेमें हिस्सा बस के ऊपर एक कपास प्लग डालें.
    2. नमूना प्रति दो स्तंभों के प्रत्येक के लिए, प्रत्येक स्तंभ की ऊंचाई लगभग एक तिहाई भरने का आरोप लगाया मोतियों जोड़ें. कार्बनिक अम्ल निकासी के लिए AG1 मोती का उपयोग करें. एमिनो एसिड की निकासी के लिए AG50 मोती का उपयोग करें.
  3. नमूना प्रसंस्करण:
    1. चार्ज AG1 मोती के साथ स्तंभ के लिए नमूने के 500 μL जोड़ें. नमूना के लिए कुछ नहीं जोड़ा जाता है पहले AG1 स्तंभ को लागू करने के कार्बनिक अम्ल निकालने, अगर नमूना तटस्थ पीएच पर पहले से ही है (प्रोटोकोल ए, 19B # कदम देखें).
    2. शेष नमूना AG50 स्तंभ को लागू करने के लिए अमीनो एसिड को निकालने से पहले 0.1 एन एचसीएल के 1 एमएल जोड़ें.
    3. नमूने पूरी तरह से स्तंभों के माध्यम से चलाने के लिए अनुमति दें.
    4. 10 बार पानी के साथ स्तंभ धो जब तक धोने तटस्थ (7-8 पीएच रेंज).
    5. ताजा, लेबल गिलास 4 एमएल नमूना शीशियों के लिए स्तंभों Elute:
      1. कार्बनिक अम्ल निकासी के लिए, स्तंभ AG1 3ml 3 एन एचसीएल का जोड़. इस लेबल कार्बन की कुल संख्या में 3 कार्बन प्रजातियों (लैक्टेट), 4 कार्बन प्रजातियों (aspartate, succinate, Malate) के बीच आइसोटोप संवर्धन के विश्लेषण परमिट,5 कार्बन (ग्लूटामेट) प्रजातियों, और 6 कार्बन प्रजातियों (साइट्रेट).
      2. एमिनो एसिड निष्कर्षण के लिए: AG50 स्तंभ 3ml 4 एन एनएच 4 OH जोड़ने . इस लेबल कार्बन की कुल संख्या में 3 कार्बन प्रजातियों (alanine) और 5 - कार्बन प्रजातियों (glutamine) के बीच आइसोटोप संवर्धन के विश्लेषण परमिट.
    6. Reacti VAP III के बाष्पीकरण में नमूना शीशियों सूखी जब तक रात भर रखें.

ई. नमूना और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए Derivitization मशीन सेटिंग्स

प्रत्येक नमूना शीशी acetonitrile के 50 μL और n मिथाइल-NT-butyldimethylsilyl trifluoroacetamide (MTBSTFA) का 50 μL जोड़ें. कवर, मिश्रण और 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते गैस / क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमीटर (जीसी / एमएस) में नमूना प्रति 1-2 μl इंजेक्षन.

एफ परिणाम के विश्लेषण

  1. एमिनो एसिड चोटियों की मात्रा का ठहराव. प्रत्येक अमीनो एसिड के HPLC विश्लेषण द्वारा quantitation आंतरिक मानक के प्रत्येक चोटी रिश्तेदार के क्षेत्र का उपयोग कर की गणना है.
  2. समस्थानिक संवर्धन गिना. स्थिर समस्थानिक संवर्धन एक्सेल (माइक्रोसॉफ्ट) में प्रत्येक प्रजातियों के लिए के अनुसार गणना की है निम्न सूत्र: एटम प्रतिशत अतिरिक्त, सही (बंदर) = (आर सेंट सा आर) * 100 / [(आर सेंट सा आर) 100 ] जहां आर सा नमूना और आर सेंट के अनुपात मानक का अनुपात.
  3. नमूना संवर्धन के बीच सांख्यिकीय अंतर का आकलन. छात्र के टी - परीक्षण रिश्तेदार एमिनो एसिड और नमूनों के बीच समस्थानिक लेबल मतभेद के महत्व का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

प्रतिनिधि परिणामों:

स्थिर आइसोटोप है युवा वयस्क कीड़े में अच्छी तरह से शामिल है, के रूप में लेबल वायुमंडलीय CO 2 और भंग कीड़ा सीओ 2 में मापा कार्बन द्वारा evidenced. कीड़े खिलाया में या तो जीवित या यूवी विकिरणित OP50 ई. को मार डाला कोलाई, 13 सीओ 2 से 12 सीओ 2 के अनुपात भंग कीड़ा सीओ 2 जारी वायुमंडलीय CO 2 (चित्रा 1) के सापेक्ष अंश में अधिक से अधिक था. दूध पिलाने कीड़े रहते हैं या मारे गए OP50 ई. कोलाई काफी धोया कीड़ा निकालने में मापा 13 सीओ 2 से 12 सीओ 2 अनुपात बदल नहीं किया था (देखें प्रोटोकोल C1).

जल्दी लार्वा अवधि से स्थिर आइसोटोप के लिए लंबे समय तक निवेश मध्यस्थ चयापचयों में समस्थानिक संवर्धन वृद्धि हुई है. लेबल युवा वयस्क जंगली प्रकार के कीड़े के मध्यस्थ चयापचयों में निर्धारित कार्बन की सही परमाणुओं प्रतिशत अतिरिक्त सभी ग्लूटामेट प्रजातियों भर में अधिक से अधिक था जब कीड़े खिलाया गया सार्वभौमिक लेबल 13 सी ग्लूकोज और विकास भर में जीवित बैक्टीरिया इसी तरह इलाज पशुओं के सापेक्ष 48 के लिए लेबल बैक्टीरिया खिलाया घंटे केवल अंडे बिछाने वयस्क मंच (चित्रा 2) तक पहुँचने के बाद.

समस्थानिक संवर्धन पर बार समाशोधन का प्रभाव. जोखिम timecourse के बावजूद, सभी प्लेटों पर बड़े जानवरों समस्थानिक लेबल के पहले थे 'को मंजूरी दे दी जीसी / एमएस विश्लेषण के लिए बहाव तैयारी. समाशोधन प्रोटोकॉल की तुलना के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है प्रदर्शन किया गया था एन जी एम अगर आइसोटोप या एन जी एम अगर प्लेटों पर खिला के बिना जीना ताजा बैक्टीरिया के साथ 2 घंटे के लिए बैक्टीरिया के बिना फैल प्लेटों पर 2 घंटे के लिए कीड़े, भोजन और बैक्टीरिया के बिना एन जी एम अगर प्लेटों पर खिला सहित, या तो 2 या 6 घंटे. समस्थानिक जोखिम पाठ्यक्रम के बावजूद, युवा वयस्क पूरे कीड़ा निकालने से मध्यस्थ चयापचयों में समस्थानिक संवर्धन में कोई महत्वपूर्ण अंतर है जब पशुओं प्लेटों पर या तो 2 या 6 घंटे के लिए बैक्टीरिया के बिना मंजूरी दे दी थे मनाया गया. इसके विपरीत करके, कम समस्थानिक संवर्धन मध्यस्थ चयापचयों में मनाया गया था जब जानवरों के बाद अतिरिक्त आइसोटोप के दो घंटे के लिए unlabeled बैक्टीरिया पर खिला द्वारा मंजूरी दे दी '. हालांकि, संवर्धन 3 में वृद्धि हुई है, 4, और 5 प्रजातियों स्पष्ट हो गया था जब कीड़े लार्वा अवधि की शुरुआत से आइसोटोप से अवगत कराया गया. इसलिए, इष्टतम समाशोधन प्रोटोकॉल एन जी एम स्थिर और unspread एन जी एम प्लेटों पर 2 घंटे के लिए बाद में ऊष्मायन द्वारा आइसोटोप बैक्टीरिया के साथ फैल प्लेटों पर उनके ऊष्मायन निम्नलिखित कीड़े समाशोधन निर्धारित किया गया था. ध्यान से, तरल संस्कृति में बड़े कीड़े समस्थानिक लेबल और एस बेसल के तीन खंडों में बैक्टीरिया (प्रोटोकॉल बी) के स्पष्ट धोया गया, जीसी / एमएस विश्लेषण धोने के तीसरे धोने द्वारा कोई महत्वपूर्ण समस्थानिक संवर्धन दिखाया.

इल्ली पीस मध्यस्थ चयापचयों में अधिक से अधिक संवर्धन झुकेंगे. प्रतिशत संवर्धन में समान इलाज की शर्तों का पालन मध्यस्थ चयापचयों का अनुकूलन करने के लिए, कीड़ा अकेले sonication या sonication प्लस पीस द्वारा बाधित नमूनों की तुलना बनाया गया था. चित्रा 3 से पता चलता है कि कीड़े sonication द्वारा निम्नलिखित आइसोटोप जोखिम बाधित प्लस पीस sonication केवल द्वारा बाधित नमूनों की तुलना में अधिक से अधिक समस्थानिक संवर्धन था. ये आंकड़े बताते हैं कि अधिक उप organismal भिन्न sonication द्वारा की तुलना में पीस द्वारा बाधित किया गया. बाद के अध्ययनों sonicatio बिना अकेले पीस पता चलापता करने के लिए अधिक से अधिक समस्थानिक संवर्धन (नहीं दिखाया डेटा है) को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त था.

पूरे कीड़ा समस्थानिक जोखिम मध्यस्थ चयापचय मार्ग प्रवाह के विश्लेषण परमिट. स्थिर समस्थानिक अग्रदूत के साथ रहने वाले कीड़े (प्रोटोकोल ए, 4A चित्रा) वयस्क चरण पशुओं में विकास या शुरुआत के दौरान या तो दूध पिलाने (प्रोटोकोल बी, चित्रा 4B) ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से प्रवाह के संकेत चयापचयों के बीच समस्थानिक संवर्धन के संवेदनशील विश्लेषण (लैक्टेट, alanine), पाइरूवेट परमिट (alanine) चयापचय और tricarboxylic एसिड चक्र (साइट्रेट, Malate, succinate, aspartate, ग्लूटामेट, और glutamine). सार्वभौमिक लेबल सभी कार्बन प्रजातियों में से 13 सी - ग्लूकोज मजबूत लेबलिंग प्रदान करता है, 1,6 के उपयोग जबकि 13 सी 2-ग्लूकोज केवल एक metabolite के एक प्रजातियों में मजबूत लेबलिंग परमिट. इस तकनीक संवेदनशीलता जंगली प्रकार कीड़ा मध्यस्थ चयापचय प्रवाह से mitochondrial सांस श्रृंखला उत्परिवर्ती उपभेदों के बीच जैसे जटिल III के mitochondrial श्वसन श्रृंखला सबयूनिट आईएसपी 1 (qm150) उत्परिवर्ती के रूप में मतभेद विचार कर सकते हैं. 13 सी K12 ई. के साथ तरल संस्कृति में 2 ग्लूकोज - चित्रा 5 (qm150) आईएसपी-1 और N2 प्रत्येक उजागर करने के लिए 24 घंटे के लिए 1,6 कीड़े के बीच पूर्ण लेबल में मनाया मतभेद की भयावहता को दिखाता है के पहले दिन से कोलाई बैक्टीरिया अंडे बिछाने युवा वयस्क मंच (प्रोटोकॉल बी). Mitochondrial उत्परिवर्ती कीड़े की एक सीमा में अतिरिक्त स्थिर समस्थानिक अध्ययन चल रहे हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. वैश्विक लेबल 13 सी ग्लूकोज स्थिर आइसोटोप युवा वयस्क कीड़े में अच्छी तरह से शामिल किया गया था 13 सीओ 2: 12 जंगली प्रकार दो खिला घंटे के बाद (N2) कीड़े में सीओ 2 अनुपात (परमाणुओं प्रतिशत अधिक (बंदर), सही ) को सार्वभौमिक 13 सी - ग्लूकोज और 13 या तो यूवी मारे गए या प्लेटें (C1 प्रोटोकोल) पर OP50 बैक्टीरिया रहते हैं. लेबल सी कीड़ा चयापचयों में समावेश आइसोटोप जोखिम के दो घंटे के बाद मजबूत था . नीले और लाल सलाखों रिश्तेदार समस्थानिक चरण में गैस संवर्धन ("वायुमंडलीय CO 2") और तरल चरण ("कीड़ा सीओ 2"), क्रमशः संकेत मिलता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. जल्दी लार्वा अवधि से लम्बे समय तक आइसोटोप जोखिम और बाद में बैक्टीरिया के बिना एन जी एम अगर प्लेटों पर कीड़े 'समाशोधन' युवा वयस्क कीड़े से मुक्त ग्लूटामेट में समस्थानिक संवर्धन बढ़ा ग्लूटामेट प्रजातियों में समस्थानिक संवर्धन एन जी एम अगर प्लेटों पर खिलाया के साथ कीड़े के लिए दिखाया गया है. सार्वभौमिक लेबल 13 सी - ग्लूकोज और L1 लार्वा चरण से 959 सेल युवा वयस्क मंच के माध्यम से विकास के दौरान या तो OP50 बैक्टीरिया ("L1" प्रोटोकोल ए देखें), या अड़तालीस घंटे के लिए शुरुआत जब कीड़े के पहले दिन तक पहुँच अंडे बिछाने युवा वयस्क मंच ("हां"). X-अक्ष लेबल प्रत्येक ग्लूटामेट प्रजातियों में कार्बन परमाणुओं की कुल संख्या को इंगित करता है. Y-अक्ष प्रतिशत संवर्धन (अतिरिक्त प्रति सही परमाणुओं (बंदर)) इंगित करता है. ग्रीन सलाखों से संकेत मिलता है कीड़े OP50 ई. खिला द्वारा निम्नलिखित आइसोटोप जोखिम को मंजूरी दे दी पीसीए निकासी से पहले दो घंटे के लिए एन जी एम प्लेटों पर आइसोटोप बिना कोलाई . ब्लू और ग्रे सलाखों से संकेत मिलता है कि कीड़े बैक्टीरिया या आइसोटोप के बिना दो या दो से छह घंटे के लिए एन जी एम प्लेटों पर निम्नलिखित आइसोटोप जोखिम को मंजूरी दे दी क्रमशः पहले पीसीए निष्कर्षण.

चित्रा 3
चित्रा 3. पैदावार मध्यस्थ कीड़ा चयापचयों में अधिक से अधिक समस्थानिक संवर्धन पीस द्वारा कीड़े खलल न डालें. बैक्टीरिया (बी प्रोटोकोल) के बिना 13 सी 2 ग्लूकोज - कार्बन एक जंगली प्रकार 1,6 के साथ तरल संस्कृति में 24 घंटे के लिए इलाज के कीड़े में साइट्रेट प्रजातियों में मापा संवर्धन का प्रतिशत. काले और भूरे रंग सलाखों के कीड़े है कि केवल sonication या sonication द्वारा बाधित थे और पीस, क्रमशः संकेत मिलता है. 1,6 करने के लिए जोखिम के बाद समस्थानिक संवर्धन - 13 सी 2 शर्करा एक कार्बन पर लेबल चयापचयों में सबसे अच्छा मूल्यांकन किया है . इसके विपरीत में, लेबल प्रत्येक metabolite के सभी प्रजातियों में समृद्ध है जब सार्वभौमिक लेबल-13 सी - ग्लूकोज का उपयोग किया जाता है .

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रतिनिधि परिणाम कीड़ा मध्यस्थ ग्लाइकोलाइसिस, पाइरूवेट चयापचय, और tricarboxylic एसिड चक्र के माध्यम से प्रवाह का संकेत चयापचयों में समस्थानिक संवर्धन की हद तक उदाहरण देकर स्पष्ट करना सही परमाणुओं प्रतिशत अधिक (बंदर) युवा वयस्क जंगली प्रकार (N2 ब्रिस्टल) 1 निम्नलिखित कीड़े में निर्धारित किया गया था. 6 - 13 सी या तो L1 मंच से (प्रोटोकॉल), प्लेटें, पर विकास के दौरान (ए) या ​​(बी) के शुरुआत के पहले दिन पर जोखिम 2 ग्लूकोज अंडे बिछाने तरल संस्कृति में 24 घंटे के लिए युवा वयस्कों के रूप में (प्रोटोकोल बी) . त्रुटि सलाखों जहां विश्वसनीय समस्थानिक डेटा तीन से जैविक प्रतिकृति उपलब्ध था मानक विचलन संकेत मिलता है.


चित्रा 5. निरपेक्ष जंगली प्रकार और mitochondrial उत्परिवर्ती कीड़ा उपभेदों में एमिनो एसिड metabolite प्रजातियों के एमिनो एसिड quantitation. चार अमीनो एसिड के प्रत्येक प्रजातियों में निरपेक्ष लेबल गुणा करके गणना की थी HPLC निर्धारित सही परमाणुओं प्रतिशत अधिक (बंदर) के द्वारा मुक्त एमिनो एसिड (nmol / मिलीग्राम कीड़ा प्रोटीन) प्रत्येक प्रजातियों के लिए एकाग्रता. ग्रे और काले सलाखों (N2 ब्रिस्टल) जंगली प्रकार और mitochondrial जटिल क्ष्क्ष्क्ष् सबयूनिट उत्परिवर्ती उपभेदों (आईएसपी-1 (qm150)) क्रमशः संकेत मिलता है,. बार्स तनाव प्रति तीन जैविक को दोहराने के प्रयोगों के औसत से संकेत मिलता है.

Discussion

मास स्पेक्ट्रोमेट्री लागू करने के लिए मध्यस्थ चयापचयों में समस्थानिक बहुतायत को मापने के महत्वपूर्ण जैव रासायनिक परिवर्तन 5 का एक शानदार विस्तृत चित्र देता है. यहाँ, हम इस बेहद संवेदनशील और विशिष्ट पद्धति का शोषण करने के लिए आनुवंशिक रूप से बहुमुखी मॉडल जानवर, सी. में मध्यस्थ चयापचय प्रवाह का आकलन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान की है एलिगेंस. दरअसल, स्थिर आइसोटोप के साथ रहने वाले जानवरों को खिला लेबल चयापचय व्यापारियों (जैसे 13 सी के रूप में ग्लूकोज) मध्यस्थ चयापचय मार्ग प्रवाह में उपन्यास अंतर्दृष्टि परमिट जब बहाव चयापचयों में समस्थानिक संवर्धन को मापने. हम विश्वसनीय पद्धति विकसित की है ग्लाइकोलाइसिस, पाइरूवेट चयापचय, और tricarboxylic एसिड चक्र के माध्यम से प्रवाह की मजबूत विश्लेषण प्राप्त करने के लिए. यह दोनों जल्दी लार्वा विकास चरणों से स्थिर आइसोटोप खिलाया जानवरों में या बाद mitotic वयस्क अवधि में शुरुआत हासिल किया जा सकता है. विभिन्न प्रजातियों में metabolite समस्थानिक संवर्धन उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा पूरे कृमि मुक्त एमिनो एसिड की रूपरेखा के साथ संयोजन के रूप में अध्ययन किया जा सकता है है, के रूप में पहले 4 वर्णित है, मुक्त कीड़ा alanine, aspartate, ग्लूटामेट, और glutamine की विभिन्न प्रजातियों में निरपेक्ष समस्थानिक संवर्धन निर्धारित है. दरअसल, समस्थानिक संवर्धन के अनुरूप पैटर्न जब 1,000 से 2,000 युवा वयस्क तुल्यकालिक कीड़े की aliquots में एमिनो एसिड और कार्बनिक अम्ल analytes को मापने के लिए प्राप्त कर रहे हैं. इस तरह की पद्धति संवेदनशीलता परमाणु जीन आधारित mitochondrial उत्परिवर्ती जंगली प्रकार के कीड़े सापेक्ष उपभेदों में असामान्य मध्यस्थ प्रवाह भेदभाव कर सकते हैं.

इस तकनीक की प्रासंगिकता विशिष्ट जैव रासायनिक रास्ते में प्रवाह परिवर्तन चयापचय की आम सहज त्रुटियों जांच करने के लिए महत्व रखता है. विशेष रूप से, स्थिर आइसोटोप के साथ लेबल ग्लूकोज का उपयोग mitochondrial रोग के लिए प्रासंगिकता के केंद्रीय चयापचय मार्ग के माध्यम से कार्बन प्रवाह बताते हैं. दरअसल, हमारे आंकड़े बताते हैं ऐसी पद्धति के आवेदन संवेदनशीलता परमाणु जीन के आधार पर mitochondrial जटिल क्ष्क्ष्क्ष् सबयूनिट उत्परिवर्ती (आईएसपी-1 (qm150)) तनाव जंगली प्रकार के कीड़े सापेक्ष में असामान्य मध्यस्थ प्रवाह भेदभाव कर सकते हैं.

यह महत्वपूर्ण है कि पहचान के बाद से समस्थानिक जोखिम कई दिनों के लिए एक की अवधि में पूरा हो गया है, समस्थानिक संवर्धन मात्रा निर्धारित समय का एक निर्धारित अवधि में एक "स्थिर राज्य" संवर्धन बजाय मात्रात्मक प्रवाह मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है सेल आधारित मॉडल के रूप में निर्धारित किया जा सकता है घंटे मिनट की अवधि के लिए आइसोटोप को उजागर. निमेटोड विकास के पाठ्यक्रम पर मार्ग प्रवाह पूछताछ के एक अन्य संभावित सीमा लार्वा विकास की लंबाई है कि विशेष रूप से उत्परिवर्ती उपभेदों में होने भिन्न करने के लिए संबंधित है. उदाहरण के लिए, कई गंभीर mitochondrial म्यूटेशनों तिहाई (L3) लार्वा चरण 6 में गिरफ्तारी का कारण जाना जाता है . इस प्रकार, केवल जानवरों है कि वयस्कता के लिए जीवित है आइसोटोप निगमन के विश्लेषण पूरे उत्परिवर्ती की आबादी का प्रतिनिधि नहीं हो सकता. हालांकि, इस पद्धति मध्यस्थ चयापचयों में एक विशिष्ट लार्वा चरण (जैसे L2 के रूप में) के बजाय इंतज़ार कर रहे पशुओं के लिए वयस्क अवस्था तक पहुंचने के लिए समस्थानिक निगमन का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इसी प्रकार, जानवरों है कि वैकल्पिक लार्वा dauer के रूप में की संभावना से जाना जाता है चरण में प्रवेश काफी बदल दिया है (संभावना कम) चयापचय प्रवाह जानवर जो चार लार्वा चरणों के माध्यम से सीधे आगे बढ़ना करने के लिए सापेक्ष. भविष्य के अध्ययन में यह भी सीधे dauer अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के मंच पशुओं में समस्थानिक निगमन का आकलन किया जा सकता है. एक निश्चित समय अवधि (यहाँ 24 से 48 घंटे) की शुरुआत एक बार जानवरों युवा वयस्क चरण में पहुंच के लिए स्थिर आइसोटोप के लिए पशुओं उजागर (के रूप में प्रोटोकॉल बी में विस्तृत) चर विकास अवधि के प्रभाव को हटा. जबकि 13 सी ग्लूकोज केवल ग्लाइकोलाइसिस, पाइरूवेट चयापचय और tricarboxylic एसिड चक्र प्रवाह पूछताछ, अन्य समस्थानिक tracers संभावित नेमाटोड में रुचि के अन्य रास्ते के माध्यम से जैव रासायनिक मार्ग प्रवाह पूछताछ करने के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, 15 एन ग्लाइसिन नेमाटोड में एमिनो एसिड कारोबार का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.

इस दृष्टिकोण का एक अन्य संभावित सीमा metabolite का पता लगाने की संवेदनशीलता का स्तर है. हमारा अनुभव से पता चलता है 500 युवा वयस्क नेमाटोड के एक न्यूनतम करने के लिए सफलतापूर्वक HPLC और जीसी / एमएस यहाँ नियोजित तरीके से समस्थानिक समावेश यों के लिए आवश्यक हैं. जैसे अल्ट्रा प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (UPLC) अधिक से अधिक संवेदनशीलता, के साथ उपकरणों का प्रयोग करने के लिए, जानवरों की संख्या के अध्ययन और कटौती की अनुमति है, हालांकि हम आशा करते है इस एकल कीड़े से metabolite प्रजातियों में चयापचयों और समस्थानिक निगमन के विश्वसनीय quantitation की अनुमति की संभावना नहीं है हो सकता है. हम 1,000 पशुओं के प्रति प्रयोग कीड़ा आबादी है, जो हम प्रत्येक तनाव में मज़बूती से कम बहुतायत चयापचयों का पता लगाने पाया का अध्ययन किया. हालांकि, GABA के रूप में कुछ चयापचयों,, केवल मज़बूती नेमाटोड के बहुत बड़े आबादी में कर सकते हैं मात्रा निर्धारित के आदेश पर हो1x10 6 4 जानवरों.

संक्षेप में, स्थिर आइसोटोप रूपरेखा एक गैर इनवेसिव और सुरक्षित (गैर रेडियोधर्मी) दृष्टिकोण है कि लंबे समय के लिए चयापचय की सहज त्रुटियों का अध्ययन उपयोग किया गया है प्रदान करता है. इस पद्धति के सी. के लिए आवेदन एलिगेंस उपन्यास vivo में, वास्तविक समय, चयापचय परिवर्तन है कि पूरे पशु स्तर पर होते हैं, जो व्यक्तिगत आनुवंशिक विकारों और / या pharmacologic एजेंट जोखिम से परिणाम हो सकता है में जांच की क्षमता प्रदान करता है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम के हिस्से में राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (K08-DK073545 और NICHD प्रायोजित बौद्धिक और विकासात्मक विकलांग रिसर्च सेंटर नई अन्वेषक पुरस्कार), फिलाडेल्फिया फाउंडेशन, और पेंसिल्वेनिया McCabe पुरस्कार के विश्वविद्यालय (MJF), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से त्रिस्टान के द्वारा वित्त पोषित किया गया था मुलेन फंड (MJF और मेरे). सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S. basal 1 - page 59 Protocols A and B
Cholesterol Sigma-Aldrich C-8503 Protocol B
OP50 E. coli Caenorhabditis Genetics Center Protocols A and C
K12 E. coli Caenorhabditis Genetics Center Protocol B
NGM agar Research Products International Corp. N81800-1000.0 Protocols A, B, and C
13C glucose (universally labeled) Cambridge Isotope Laboratories CLM-1396 Protocol A and C
13C glucose (1,6 labeled) Cambridge Isotope Laboratories CLM-2717 Protocol B
60% Perchloric acid (PCA) Fisher Scientific MK2766500 Protocols A and B
ε-aminocaproic acid (Internal Standard) Sigma-Aldrich A-2504 Protocols A and B
MTBSTFA Regis 270243 Protocol E
Acetonitrile Regis 270010 Protocol E
AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin Bio-Rad 140-1441 Protocols A and B (organic acid extraction)
AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin Bio-Rad 142-1441 Protocols A and B (amino acid extraction)
NaHCO3 Sigma-Aldrich S-8875 Protocol C
NaOH Sigma-Aldrich S8045 Protocol C
3N HCl Sigma-Aldrich 320331 Protocol D
1N HCl Sigma-Aldrich 320331 Protocol A
0.1 N HCl Sigma-Aldrich 320331 Protocol D
4N NH4OH Sigma-Aldrich 30501 Protocol D
4N KOH Sigma-Aldrich 484016 Protocols A and B
Deionized water Milli Q Biocel ZMQA60F01 Protocol D
Helium Airgas 24001364 Protocol C2
SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope Nikon Instruments NI MNA41000 Protocols A, B, and C
pH meter Fisher Scientific S68167 Protocols A and B
Table top centrifuge - 5804R Eppendorf 05-400-93 Protocols A and B
Incubated platform shaker New Brunswick Scientific M1324-0004 Protocol B
Mini LabRoller Rotator Labnet International H-5500 Protocols A and B
Pestles Kontes Corp K749520-0090 Protocols A and B
Drill Kontes Corp K749540-0000 Protocols A and B
1 L glass beaker Fisher Scientific 02-539P
1 L Erlenmeyer Flasks VWR international 89000-368
25 mL Erlenmeyer Flasks VWR international 89000-356 Protocol B
7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper VWR international VT6431 Protocols A, B, and C1,C2
10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper VWR international VT6430 Protocol C2
Blue top tubes Labco 438B
50 ml conical plastic tubes Falcon BD 14-959-49A All protocols
1.5 ml microfuge tubes Fisher Scientific 02-681-320 Protocols A and B
Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL) BD Biosciences 301025, 301029, 301031 Protocols C1 and C2
25 gauge needles Fisher Scientific 22-253-131 Protocols C1 and C2
Poly-Prep Chromatography Columns Bio-Rad 731-1550 Protocol D
Pasteur pipettes VWR international 14673-043 Protocol D
60mm Petri dishes VWR international 25373-085 Protocol C
Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock Custom Made Protocol C
Optically transparent glass plate Custom Made Protocol C
Reacti-Vap III Evaporator Thermo Fisher Scientific, Inc. 18826 Protocol D
Cotton VWR international 14224-516 Protocol D
High Vacuum Grease Dow Corning 1597418 Protocol C1
Aluminum Foil Fisher Scientific 01-213-18 Protocol B
Timer ISC Bioexpress T-2504-5 Protocol C
Gas-Ratio Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific, Inc. Protocol D
GC-MS Hewlett-Packard 5980/5971 Protocol D
GC-MS Agilent Technologies 6980N/5973N Protocol D
HPLC Varian Inc., Agilent 9010 Protocol D

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References

  1. Hope, I. A. C. elegans: A practical approach. , University Press. Oxford. (1999).
  2. Dingley, S. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).
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Falk, M. J., Rao, M., Ostrovsky, J., Daikhin, E., Nissim, I., Yudkoff, M. Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (48), e2288, doi:10.3791/2288 (2011).

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