Umfassende & Kostengünstig Laboratory Überwachung von HIV / AIDS: eine afrikanische Role Model

Summary

Anti-retrovirale Therapie von HIV / Aids zu behandeln, ist in Südafrika in großem Umfang überwacht. Die Durchflusszytometrie ist für Hämatologie (CD45), Immunologie (CD4) und Viruslast verbunden CD38-Assay kombiniert. Aufgenommen in den NHL-SA Labors, Johannesburg, sind diese modernen Methoden kostengünstig mit erhöhten lokalen internen Qualitätskontrolle, die als Vorbilder für die begrenzten Ressourcen Diagnostik.

Abstract

Wir präsentieren das Video über die Unterstützung anti-retrovirale Therapie (ART) durch ein apt-Labor-Service - das entspricht einem südafrikanischen Vorbild für wirtschaftliche großem Umfang diagnostische Tests. In den Ländern mit niedrigem Einkommen kostengünstige ART hat die Aussichten für das Überleben von HIV-seropositiven Patienten verwandelt, aber es gibt Zweifel, ob es notwendig ist, für das Labor Überwachung von ART und was kostet es - in Situationen, in denen die allgemeine Qualität der Pathologie Dienstleistungen noch sehr gering sein. Die passende Antwort auf wirtschaftlich solide Leistungen mit einer besseren Koordinierung und strengere interne Qualitätsbewertung als in westlichen Ländern gesehen zu etablieren. Das Video, an der Stelle in den National Health Laboratory Service (NHL-SA) an der Witwatersrand University in Johannesburg, Südafrika, fotografiert bietet so eine koordinierte Regelung Erweiterung der ursprünglichen 2-Farben-CD4-CD45 PanLeucoGating Strategie (PLG). So die sechs Module der Video-Präsentation zeigen die Einfachheit eines 4-Farb-Durchflusszytometrie-Assay zur hämatologischen, immunologischen und virologischen Tests im Zusammenhang in einem einzigen Rohr verbinden. Diese Video-Module sind: (i) die Einrichtung von Instrumenten, (ii) Probenvorbereitung, (iii) Prüfung absolute zählt und Überwachung der Qualität für jede Probe von Bead-Zählrate, (iv) die heamatological CD45 Test für weiße Zelle zählt und Differentiale, (v) die CD4-Zellzahl, und (vi) die Aktivierung von CD8 + T-Zellen durch CD38-Anzeige gemessen wird, eine Viruslast im Zusammenhang Parameter. Die potenziellen Kosten-Einsparungen sind beachtlich. Diese Anordnung ist ein Paradebeispiel für die Machbarkeit der Durchführung> 800-1000 Tests pro Tag mit einer strengeren Qualitätskontrolle als in westlichen Labors angewendet wird, und auch mit einem Transfer von Technologie an andere Labors in einem NHL-SA-Netzwerk. Fachberater-, Labor-Manager und Politiker, die die Pflicht der Entscheidungsfindung über die Einführung moderner Medizintechnik tragen, sind häufig nicht in der Lage, die neusten technischen Details, wie sie in den großen regionalen Labors mit großen Belastungen der Arbeitsbelastung durchgeführt. Daher dieses Video zeigt Details dieser neuen Entwicklungen.

Protocol

Einführung

Die modernen wissenschaftlichen Anstrengungen auf dem Gebiet der Biomedizin, praktische Vorteile, einschließlich der Einführung von effizienten Diagnostik von Infektionskrankheiten führen. Hohe Qualität und schnelle Diagnose erforderlich sind, weil die Gefahr der Ausbreitung der Krankheit aufgrund der globalen Reise-und die aktuelle verheerenden Auswirkungen von viralen und bakteriellen Infektionen in den armen Teilen der Welt ^1.

In Ressource armen Ländern Behandlung von HIV-positiven Patienten mit anti-retroviralen Therapie (ART) wurde erfolgreich ^2,3 eingeführt. Die Protokolle der ART derzeit auf (i) der serologischen Tests für HIV + Personen basiert, (ii) die einmal tägliche Kombinationen von genetischem medikamentöser als "first-line" ART verwendet und (iii) die CD4-und / oder Viruslast-Tests zu entscheiden, wann ART zu beginnen. Die Protokolle sind jedoch verändert sich der Spielraum für ART kann nun weiter mit entspannter Richtlinien ART früher einleiten bei höheren CD4 erweitert werden zählt ^2. Wichtig ist, dass die Erhöhung der Zahl der HIV + Patienten, die ART erhalten bei höheren CD4 + Zellen / ul Blut sogar zu verlangsamen, kann die Ausbreitung von HIV trotz der derzeitige Mangel an Impfstoff gegen HIV ^{4, 5.}

So HIV-Infektion ist im Begriff, eine chronische Erkrankung in eine wachsende Zahl von Überlebenden geworden und erfordern organisierten Medizin mehr denn je, aber den schlechten Zustand der Labormedizin in Afrika vielleicht noch eine Barriere von effektiven Gesundheitsversorgung ⁶ bleiben. Es gibt Stimmen, die betonen, dass die Bereitstellung von kurzfristigen Finanzhilfen nicht nachhaltige Lösungen ^7-9, und die HIV-bezogene Zuschüsse von den westlichen Ländern auf den aktuellen Maßstab geliefert kann nicht ewig ^8,9 fortzusetzen. Im Jahr 2008 USD 15,6 Mrd. auf AIDS-Programme in niedrigem und mittlerem Einkommen Ländern ausgegeben, und etwa 50% davon wurden von externen, einschließlich Nordamerika, Quellen. Die berechneten Trends zeigen, dass diese Ausgaben um bis zu 2-3 mal höher, und dass die Epidemie immer noch mit uns im Jahr 2031, es sei denn es gibt eine Änderung in der aktuellen globalen Ansatz ⁹ ist.

So afrikanischen Ländern muss durch eine bessere HIV-Prävention und weiser Kosteneinsparungen ⁹ tragen. Hier empfehlen wir, dass die jüngsten erfinderischer "Vorbilder" für die tägliche Arbeit geschaffen wird und eingeführt in ressourcenarmen Ländern (zB in Afrika oder Indien). Dies sind die Gebiete der Erde, wo die Wissenschaftler lernen, vollständig von den aktuellen internationalen Unterstützung in Anspruch nehmen und dann wird, um ihre Fähigkeiten zu nutzen, um weiter zu verbessern täglichen Technologie, durch einen Beitrag zur globalen Entwicklung.

In der westlichen Medizin die diagnostische Tätigkeit in großen akademischen Zentren und Krankenhäusern häufig "departmentalisierten" sind, dh getrennte Zonen "von Interesse" kann für die verschiedenen Disziplinen, die zu einer Zersplitterung in Hämato-, Viro-, retroviro-, bakteriologischen, serologischen existieren , Immun-und zytologischen Labors statt der Durchführung einer Vereinheitlichung Ansatz mit einem minimalen Satz von multidisziplinären diagnostischen Tests in einer ansteckenden Krankheit-Labor. Darüber hinaus können die Diagnosetests auch viel zu kompliziert und kostspielig. Natürlich würde eine solche Dienste müssen besser koordiniert werden, aber diese Vereinigung Bemühungen ist unwahrscheinlich völlig stammen aus westlichen Richtungen. Folglich sind die führenden Labors und Instituten, wie dem National Health Laboratory Service (NHL-SA) in Kooperation mit der Universität Witwatersrand in Johannesburg, Südafrika, vor einer zusätzlichen Aufgabe weiter zu entwickeln, zu verändern, neu ausrichten und verbessern ihre kostengünstige Diagnose auf moderne Technologie.

In der aktuellen video beschreiben wir durchflusszytometrische Methoden, um die anti-retrovirale Therapie (ART) bei HIV-infizierten Patienten zu überwachen. Diese Technologie wird schrittweise in sechs Modulen für eine Kombination aus präsentiert relevant Hämato-, Immun-und virologische Untersuchungen in einer einzigen Röhre, mit ätherischen interne Qualitätskontrolle (QC) kombiniert, um die Reproduzierbarkeit des Tests ^{10 zu} gewährleisten. Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern verwendet hier sind alle wissenschaftlich voll etabliert. Das CD45-Reagenz für weiße Blutkörperchen ^11-13, mit CD4 kombiniert, um die "Helfer" T-Lymphozyten, die den primären Ziele für die HIV ^12-14 sind aufzulisten. Es ist eine "konstruktive Trick", dass in der gleichen Röhre des CD38 Aktivierungsmarker auf CD8 + T-Zellen wird als HIV Viruslast (VL) im Zusammenhang Assay ^15-17 festgestellt. Um den südafrikanischen Beitrag zu betonen, weisen wir darauf hin, dass diese Konzepte und ihre kostengünstige praktische Kombinationen alle wurden in NHL-Wits Kooperationen auf den führenden westlichen Technologien ^{10,12,13,16,17} Basis gearbeitet.

Diese Assays, in Kombination durchgeführt werden würde für die ordnungsgemäße Überwachung der Patienten, die sich langfristig in ART benötigt werden. Wenn die Kosten-efficiency untersucht wird, ist dies koordiniert Durchflusszytometrie-Technologie erweist sich als wirtschaftlich ^16,18,19. Diese Single-Tube-Assays stellen kostensparend über ihren westlichen Varianten und über die ähnliche Tests durch separate Instrumente und / oder getan durchgeführt, wie verschiedene Surrogat-Tests mit anderen Methoden. Diese Einsparungen sind in der Diskussion aufgeführt.

Für die Akzeptanz dieser im Grunde nur Technik, die Vier-Farben-Durchflußzytometrie nutzt in einer einzigen Röhre, ist es wichtig, die technischen Schritte in ein Video-Format zu zeigen. Fachberater-, Labor-Manager und Politiker, die die Pflicht der Entscheidungsfindung über die Einführung moderner Medizintechnik tragen, sind häufig nicht in der Lage, die neusten technischen Details, wie sie in den großen regionalen Labors mit großen Belastungen der Arbeitsbelastung durchgeführt. Daher dieses Video zeigt Details der neuen Entwicklungen, die in Südafrika eingeführt haben, um den Workflow für das Testen> 1000 klinische Proben jeden Werktag ^10,13,16,17 optimieren.

Protokoll

Durchflusszytometrie

Die Tests wurden durch 4-Farb-Durchflusszytometrie durchgeführt, aber die Tests können auch mit 2-Farben in zwei parallelen Röhren (siehe unten). Die Beckman-Coulter XL-MCL, ein Zytometer stabiler Fluidik ^21, verwendet wird, aber die gleiche Technologie kann auch für andere Zytometern. Die beschriebene Technologie verarbeitet große tägliche Arbeitsbelastung von ~ 800-1100 Proben / Tag ^10,13.

Modul 1: bis Instrumenten-Set

Tägliche Instandhaltung des Hauses ist die Reinigung durchführen zweimal am Tag: beim Start-up und nach Abschluss der letzten Patientenprobe. Dazu gehört auch die Spülung von Vakuumleitungen und den Erwerb Clenz (5% Natriumhypochlorit; BC, Miami, FL). Außerdem ist am Ende eines jeden 30-tube Karussell Clenz und destilliertes Wasser durch das System laufen, um Protein zu minimieren build-up.

Am Tag der Inbetriebnahme der Vakuum-und Druckwerte werden überprüft. Es wird bestätigt, dass der Hintergrund zählt akzeptabel bleiben (<100 Veranstaltungen in 100 sec). Nach dem Ausführen der ersten Blutprobe festgestellt wird, dass in einem Aliquot Hüllfluid die Verschleppung <1% ist. Dann Laserausrichtung und Fluoreszenz-Empfindlichkeit sind täglich überwacht anhand einer Stichprobe von FlowCheck ^21. Es wird beobachtet, dass der mittlere Kanal Zahlen konsistent sind (500 ± 50) mit einer geringen Abweichung (halbe Spitze CV-Werte <2%). Die Entschädigung wird wöchentlich überprüft; FlowSet Perlen aufgetragen, um zu sehen, ob der Mittelwert Kanalwerte innerhalb von 1% des vorgegebenen Soll-Werte ²² sind. Um visuell zu bestätigen, die Präzision auf Levey-Jennings Plots, die mittlere Kanalnummern und die Hälfte peak Variationskoeffizient (HPCV)-Werte für die vier Fluoreszenz-Kanäle (FL1-FL4) werden täglich angezeigt. Als nächstes wird die Genauigkeit der CD4-Zellzahl ist bei den beiden CD4 Ebenen bestätigt. Während einer PLG-CD4-Test stabilisiert Blut Prozess-Kontrollen (IMMUNOTROL) sind die niedrig normal verwendet werden (450 bis 700 CD4 Zellen / ul) und das niedrige Niveau (100-200 CD4-Zellen / ul, je nach Charge; ref 23). Diese Immunotrol Werte sind erforderlich, um innerhalb von 0,5 SD vom Mittelwert mit einem% CV <5% werden von der internationalen BC-IQAP Programm ^24, UK NEQAS ²⁵ und AFREQAS ²⁶ angefordert. Es ist wichtig, dass mit diesen einfachen organisierten Maßnahmen, wie in dem Video zu sehen das robuste Durchflusszytometer kann die notwendige Stabilität für beide absolute Zellzählung wie CD4-Tests und für Messungen der Fluoreszenzintensität für die Aktivierung Marker CD38 verwendet aufrecht zu erhalten. Diese Stabilität hat vor kurzem im Detail ^{17 zur} dokumentiert bestätigen frühere Studien mit anderen Zytometern ^15,27.

Bei der wöchentlichen Wartung der Liste Modus werden die Daten (LMD)-Dateien sind für zukünftige Referenz archiviert und diese archiviert Material wird dann von der Zytometer Festplatte gelöscht.

Monatliche Wartung umfasst die Reinigung der Reagenzbehälter, der Mantel, Clenz und Tanks für Abfälle. Das Karussell-Modus Probenkopf wird gereinigt, während alle Filter sind auch abnehmbar und waschbar. Diese Reinigung ist auch die Vorbereitung Stationen TQPrep und PrepPlus2 (BC, FL) erweitert. Die Pipetten für die manuelle Aufbereitung verwendet werden in-house validiert mindestens alle 3 Monate, aber wenn Pipettieren Ungenauigkeit der Verdacht der Pipette wird sofort außer Betrieb Korrekturmaßnahmen ergriffen. Sechs monatliche Wartung wird von der Beckman Coulter, SA geplant.

Modul 2: Probenvorbereitung

Für die CD45/CD4 zweifarbige PanLeucogated Protokoll Nr. ⁵ der Beckman Coulter FlowCARE Kit ²⁸ ist in einem Lyse-no-wash-Verfahren (IMMUNOPREP, Beckman Coulter, FL) verwendet. Dieses Kit enthält CD45-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC, grün) und CD4-Phycoerythrin (PE; orange). Flow-Count Perlen ²⁹ sind in der Masse gekauft und werden addiert, um eine besondere bedienerfreundliche Rolle als bekannt numbe spielenrs von Perlen in einem bekannten Volumen sind auf der Stelle in die Probe ³⁰ pipettiert. Dies ist mit der gleichen Pipettieren wie früher das Blutvolumen liefern getan. So ist die Beadzahl Rate (BCR) im erwarteten Bereich zeigt, dass das Pipettieren in der gegebenen Probe genau geschehen ist, wie in Modul 3 beschrieben. Wichtig ist, dass hier die einfache Pipettieren Methode, die so genannte 'forward Pipettieren ", am besten funktioniert, vorausgesetzt, dass der Wulst-und Blut-Laufwerke werden mit dem gleichen Pipette und Spitze und mit identischer Bedienung 30 geliefert. Wir fanden, dass uns Pipettieren optimale Gesamtlösung Einheitlichkeit zwischen den Laboratorien, die beide ergab im Hinblick auf Anwender erreichen Pipettieren Ziele innerhalb akzeptabler Toleranzgrenzen und Reproduzierbarkeit wiederholter Dosierung als der Koeffizient der Variation (% CV) ^10,31,32 gemessen. Diese Methode, die auf lokaler Kongresse ³² dargestellt, ist für den Einsatz unter der South African National Accreditation Scheme (SANAS, www.SANAS.co.za) Richtlinien zugelassen. Das BCR Verwendung von Perlen ist von den anderen volumetrischen Zählverfahren, wo am häufigsten das lyophilisierte bead Produkt wie der BDS TruCOUNT Präparate verwendet, die eine bekannte Anzahl von Perlen. Diese Vorbereitungen sind hervorragend, um die Stabilität der Fluidik der Strömung Instrumente durch die Strömung Count Rate (FCR)-Methode ^20,31 Dokument. Dennoch macht die Verwendung von vorgefertigten Bead-haltigen Röhrchen die Technik komplizierter, weil hier es unerlässlich, die das Blutvolumen in diese Rohre liefern mit größter absolute Präzision. Es ist allgemein anerkannt, dass für diesen Zweck nur die "Reverse-Pipettieren"-Technologie akzeptabel ist nach geltenden Ausbildung. Unsere BCR-Methode ist daher weniger teuer, informativer, einfacher und leichter zu lernen, wie in dem Video zu sehen -. Wenn die alternative ähnliche Methoden ^10,31,32 im Vergleich Wir finden auch, dass die Betreiber mit uns Pipettieren weniger wahrscheinlich sind absaugen Probe in die Pipette, die mit Reverse Pipettieren sowohl die Schäden an den inneren Mechanismus und die Notwendigkeit einer Re-Kalibrierung, die nur schwer in entfernten Standorten ist führen kann. Unsere BCR-Methode auch entfällt die Notwendigkeit für Pipettierautomaten in der kleinen bis mittelgroßen Laboratorien (Liste 1).

Die Blutproben sind immer in der Klasse II Biohazard Schränken verarbeitet. Um umfangreiche Lärm während der Dreharbeiten zu vermeiden, wird das Video gezeigt, die Re-Inszenierung mit unbedenklichen Materialien außerhalb dieser Schränke. Die PLG-CD4 Übernahme-Protokoll auf dem Durchflusszytometer ermöglicht eine Zeit, um bei einer bestimmten Frist beendet oder fortgesetzt werden bis 5000 Lymphozyten Veranstaltungen zu erwerben, um die Genauigkeit bei Proben mit niedrigen CD4-Werten verbessern.

Modul 3: Die Beadzahl Rate (BCR)

Überwachung bead Zählraten (BCR) in unserem System oder jeder Kontrollprobe ist mit folgender Formel berechnet bead Veranstaltungen / Sekunden ^{10,13,30,32,33.} Der Mittelwert, SD und% CV-Werte auf einer Tabelle verwendet werden, um eine Sequenz Grundstück zur Identifizierung BCR Ausreißer ^{30 zu} erzeugen. Diese bestätigen den optimalen Betrieb der drei Systeme von Pipettieren, Verarbeitung und Analyse genannt Probenvorbereitung Verifikation (SPV), angewendet, um sowohl die Proben pipettiert manuell oder mithilfe der PrepPlus2 Pipettierautomaten Instrument ^10.

Während der Akquisition der BCR Ergebnisse werden direkt in Echtzeit auf dem Monitor angezeigt. Auf dem BC Zytometern den Wert des mittleren BCR beträgt 80 ± 5 Ereignisse / sec. Wir zeigen, dass die aberrante BCR-s identifiziert und re-run, bevor der Patient Ergebnisse veröffentlicht werden. Die Entscheidung-Tree-Algorithmus ist in Abbildung 1 dargestellt (siehe auch Ref. 10).

Funktionsstörungen werden durch Schwankungen in BCR angezeigt, wenn während der Längs-Präzision Prüfung (LPV) überwacht, um Pipettieren Trends, Muster und plötzliche Verschiebungen ^{10 zu} detektieren. Fluidics Präzision Prüfung (FPV) ist eine optionale Inhouse-Verfahren, bei dem einer einfachen Verdünnung von Perlen in 10 Röhrchen für die serielle Akquisition aliquotiert ist es, Anzeichen von fluidischen Instabilität auf eine potenziell misbehaving Instrument ¹⁰ zu bestätigen.

Modul 4: CD45

Für die Routine absolute zählt in unseren Studien ein großes Blutbild Analysator LH-750 (Beckman Coulter), kalibriert monatlich, wird täglich als Referenz für die weißen Blutkörperchen gezählt (ÖRK), gegen die die Durchflusszytometer verglichen werden. Das CD45-generated ÖRK-s auf dem Durchflusszytometer werden auch täglich durch den Vergleich mit den drei Ebenen stabilisiert Beckman Coulter 5C Vollblut Zelle steuert validiert. Die zulässigen Grenzwerte der ÖRK-Vereinbarung zwischen der Strömung CD45 zählt und großes Blutbild Analysatoren sind <5% ^10. Dies deutet darauf hin, dass, wenn die Ressource Einschränkungen schwereren dann in unseren Service als ein einziges Instrument, wie einem Durchflusszytometer sind, scheint ausreichend zu sein, die klinisch angemessen ÖRK einschließlich CD4-Zellzahlen stellen.

Weiß cell Differential zählt, sind auf verschiedenen hämatologischen Analysegeräten, die unterschiedlich durchgeführt, insbesondere bei der Beurteilung der Monozyten zählt. Das Muster der differentiellen CD45-Expression ist eine klassische Anwendung von Flow-Technologie für differentielle ÖRK ^{11,12, 34.} Da die Durchflusszytometer gewonnenen CD45 ÖRK und Differential zählt nachweislich zu genau, präzise und robust, lassen sich diese routinemäßig in die PLG-CD4-Test-Methode einbezogen werden und auch zur Verfügung gestellt Ärzte ohne zusätzliche Kosten.

Abnormal CD45 Muster werden auf CD45/side Streudiagramme des PLG-CD4-Protokoll vermerkt und Follow-up auf einem gefärbten Blutausstrich zu weiteren klinischen Untersuchung aufgefordert. Diese Methode erkennt Infektion (bakterielle und virale), Leukämien und Lymphome auf beiden HIV-negative und HIV + Patienten ^{34, 35.} Während einer Routine-Labor Follow-up in HIV + Patienten der Blutbild ist häufig nicht aus der Hämatologie-Labor angefordert. Deshalb ist die abnorme CD45 Muster sind diagnostische, wenn offen in Proben für die CD4-Zellzahl geschickt beobachtet. Ein weiterer Vorteil ist, dass die genaue absolute CD4-Zellzahl kann immer noch gemacht, sogar bei Patienten mit den Ergebnissen von Leukämie oder Lymphom im Blut ³⁵ sein.

Flow-CD45 ist gut geeignet, um Hämatologie standardisieren. Die hämatologische Instrumente deutlich voneinander unterscheiden. Wir schlagen vor, die Einführung des CD45-basierte durchflusszytometrischen Qualitätskontrolle für die WBC Differentiale zu vergleichen und zu standardisieren, die hämatologischen Analysegeräten ^10,36.

Modul 5: CD4

Die PLG-CD4-Protokoll auf dem Beckman Coulter XL-Software eingeführt besteht aus acht dot-Plots. Von diesen 4 werden verwendet, um die CD4-Zellzahl und 4 sind für die Qualitätsüberwachung ^12,13 zu bestimmen. Unter diesen sind die beiden dot-Plots in Abb. 2 dargestellt wichtig. Alle weißen Zellen werden anhand CD45 und side scatter (Bereich A Dot-Plot 2), während Ablagerungen, rote Blutkörperchen / Geister und Thrombozyten werden ignoriert. Die CD45 + Ereignisse werden dann zu dot-plot 3 übertragen, wo CD4 +-Lymphozyten zeichnen sich durch ihre helle CD4-Expression und Low-Side-Scatter (Bereich C) identifiziert. Absolute CD4 + Lymphozytenzahl sind von der Anzahl der Ereignisse in der Region C und WCC (in der Flow Count Kalibrierung Region F) berechnet. Die Werte für CD4% der Lymphozyten sind von Region B Dot-Plot 2 erhalten. Die stark CD4 + T-Lymphozyten und die schwach CD4 + Monozyten werden durch CD4-Fluoreszenz-Intensität und Streuung Features ohne die Notwendigkeit für den Einsatz eines zusätzlichen CD3 T-Zell-spezifischen Antikörper im Reagenz-Cocktail (reviewed in ref.13) diskriminiert.

Modul 6: CD8/CD38

CD8-CD38-Färbung ist ein Teil der 4-Farb-Färbung unter Verwendung CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD38-PC5. Die CD4/CD45 ist die gleiche wie oben (Flow Pflege PLG-CD4), und die zwei zusätzlichen Reagenzien hinzugefügt werden CD8-ECD/CD38-PC5 ^17. Wenn ein Zytometer läuft nur zwei Farben, ist ein extra Röhrchen gegeben, um CD8-FITC/CD38-PE zweifarbige Färbung durchzuführen, wobei wieder die Lyse-no-wash-Verfahren (IMMUNOPREP, Beckman Coulter, FL). A-Gating-Strategie ähnlich CD4 wird verwendet, um CD8 + T-Zellen mit CD8-ECD vs side scatter (Abbildung 3) zu identifizieren. CD38 Expression auf der CD8 +-Lymphozyten als einzigen Parameter Histogramm der CD38-PC5 aufgetragen mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) vs Zellzahl ^16,17. Die CD38 MFI-Werte werden der Reihe nach für jeden Besuch des gleichen Patienten dargestellt. Der erste Besuch (vor der Behandlung) ist der 'baseline' MFI-Wert, zu dem jeder andere Besuch der gleichen Person CD38 MFI ¹⁶ verglichen wird.

Bedienelemente und Instrumente Stabilität in Modul 1 beschrieben wird, auf das tägliche Übernahme von Flow-basierte Prüfen Laserausrichtung und Spannungsstabilität überwachen. Flow-Set setzt die Farbe Entschädigung für alle vier fluoreszierende Kanäle (siehe oben). Immunotrol ist die "negative" Prozesskontrolle Probe. Die "positive" Kontrollen sind die Monozyten im normalen Blut auszudrücken 9 x 10 ³ CD38-Moleküle pro Zelle, und eine bekannte HIV + Probe unbehandelt ^17.

Das Netzwerk der South African National Health Laboratory Service (SA-NHL) Labors ist die angenommene

Methoden der Qualitätskontrolle standardisiert in 70 Labors ^{13, 33} mit einer zentralen Datenbank mit Standard Operating Procedures und Schulungsmaterial. Laboratories in das Netzwerk werden durch Diskussionen, Weiterbildung und regelmäßige Vorsingen einschließlich der Kontrolle der Pipettieren Technologie ^32,33 geholfen. Die Qualitätsbeurteilung Programm wird monatlich überprüft. Auf diese Weise ist das Qualitätsmanagement regional, sondern übertragen hohen Standards sind mit dem Beitrag der SA-NHL QA-Abteilung ^{13, 26} gehalten.

Liste 1 Potenzielle Kosteneinsparungen mit koordinierten Zytometrie in der HIV-Erkrankung.:

1. Die Verwendung eines einzigen Instruments mit Vertrautheit und Service-Vertrag, statt apAufdrängend mehrere hämatologischen, immunologischen und virologischen Instrumente
2. Die Leistung des Assays in einem einzigen Rohr ohne zusätzliche Kosten und ohne Versenden der Proben zu und von verschiedenen Standorten aus sowohl ÖRK, WBC Differential zählt CD4-Tests und CD38MFI Überwachung Reaktion auf ART vorhersagen
3. Sofortige Meldung des Ansprechens auf die ART mit CD38 MFI Berichterstattung deutlich zu verbessern Durchlaufzeiten gegenüber herkömmlichen HIV VL Berichterstattung (real-time)
4. Die Klarheit und die klinische Anwendung der kombinierten Auswertung der Ergebnisse auf dem gleichen Meldeformulare
5. Die Notwendigkeit für Pipettierautomaten Instrumente können als die einfache Methode der "forward-Pipettieren" verwendet wird und die Proben werden überwacht von BCR negiert werden,
6. Während des Betriebs wird fehlerhafte Handhabung der Proben identifiziert und die problematische Testergebnisse behoben werden, bevor Ergebnisse berechtigt sind
7. Proactive präventive Management für Fehlfunktion des Geräts führt zu früh Service Buchung vor einem schweren Crash
8. Diagnose unvermutete Fälle von Leukämie / Lymphome während der routinemäßigen Service-Aktivitäten
9. Ausdehnung ähnlicher Flow-Technologie für Leukämie Phänotypisierung und Überwachung
10. Die Koordination des CD38-Test mit Speicherung der eingetrockneten Blutflecken (DBS) für HIV VL Tests bei allen Patienten und spart Kosten, indem DBS für die Auswertung nur, wenn es klinische oder CD38 Hinweise dazu
11. Ähnliche Flow-Technologie zu ersetzen Interferon-γ ELISPOT-Methode bei der Tuberkulose-Tests
12. Qualitätskontrolle für periphere Laboratorien, die den "point-of-care" CD4-Tests durchführen
13. Speichern der Kosten für die "unerwünschten" Reagenzien wie Antikörper gegen CD3 und Teilmenge Marker (aber den Kauf CD38 statt)
14. Ankauf von preiswerten Perlen für BCR-Tests (statt teure Vor-pipettiert Zähl-Rohre)
15. In einem Netzwerk, gemeinsame Verhandlungen für vorteilhafte Preise Bulk mit den Unternehmen der gewerblichen Wirtschaft

Abbildung 1. Ein Entscheidungsbaum / Algorithmus verwendet, wenn eine Probe getestet und weist ein abgelegenes Ergebnis der Raupe Zählrate (BCR). Die Hauptaufgabe besteht darin, Pipettierfehler gegenüber intermittierenden volumetrische Fehler auszuschließen. Das Diagramm zeigt die wahrscheinlichen Ursachen von Fehlern. Es ist auch darauf hingewiesen, dass die Protokoll-Histogramme und Statistiken ¹⁰ sind betroffen.

Abbildung 2 Ein Beispiel für die PLG CD4-Protokoll, das CD45-FITC (grün; x-Achse) integriert. Vs side scatter (Komplexität, y-Achse) und CD4-PE, (orange; X-Achse) vs side scatter ( Komplexität; y-Achse). Das Tor 'A' ist die Gesamtzahl der weißen Zellpopulation mit dem gewählten Tor von Lymphozyten, B '. Das Tor 'A' ist die zweite Diagramm auf der rechten Seite übertragen, um die CD4 +-Lymphozyten im Gate 'C' zu identifizieren.

Abbildung 3 Die Kombination von CD45/CD4 panleucogating Assay. (In Diagrammen '2 'und '3', siehe auch Abb. 2) mit dem CD8/CD38 Assay (in Diagrammen '4 'und '6). Wenn die gesamte Leukozyten (Gate 'A') zu Diagramm '4 übertragen werden ", hier der CD8 +-Lymphozyten sind auf der Basis von CD8-ECD gated ('x'-Achse) und side scatter (' y'-Achse; wie gezeigt in Tor 'D'). Dann werden die CD8 +-Zellen sind dem Diagramm '6 'übertragen auf die CD38-PC5 Färbeintensität in einer Single-Parameter Diagramm visualisieren. Dies wird als der Parameter 'G' im Diagramm '6 'gezeigt. Die mittlere Fluoreszenz CD38-PC5 Intensität (MFI) wird aufgezeichnet. Auf ART dieser Wert allmählich ab ^16,17.

Discussion

In den letzten Jahren die Liebe angetrieben und gewähren zugewiesenen Programme haben die Einrichtung von einigen hervorragenden klinischen Praktiken in Ressource begrenzten Gebieten der Erde mit hoher HIV-Belastung beigetragen. Die ART-Programme wurden bei der Verringerung der Sterblichkeit erfolgreich und werden nun bei höheren CD4 initiiert zählt ^2,3. Es gibt bereits Anzeichen dafür, dass diese neuen Maßnahmen die Ausbreitung der HIV-Infektion ^4,5 abnehmen wird, trotz des Fehlens einer HIV-spezifischen Impfstoff. In unserem Video dokumentieren wir, dass bei der Überwachung von Patienten mit ART, können diese Techniken besser fokussiert werden und sich kostengünstiger als die in der täglichen Praxis in westlichen Labors (Liste 1) beobachtet wurden.

Solch ein afrikanischer Führung Ansatz kann gut sein, wesentlich für die Verbesserung der Laborleistungen in einer Zeit zu unterstützen, wenn eine HIV-Infektion, mit ART behandelt werden, ist immer eine chronische Erkrankung. Eine solche Überwachung von ART erfordert eine präzise CD4 Zählen und Viruslast verwandte Technologie, eine anspruchsvolle Aufgabe, als sich einfach durchführen CD4-Zählung für die Platzierung von Patienten in beliebige Gruppen, um eine Entscheidung über das Starten Art. ¹⁶ zu unterstützen. Mit Hilfe dieser Diagnostik, dh mit dem CD8/CD38 testen, ist es möglich, die VL-Monitorings Kosten in> 60% der Patienten auf ART ^16,19 reduzieren. Es ist auch wichtig zu betonen, dass es die CD8/CD38 test ^16,17 ist, und nicht die CD4-Zellzahl ^37, die wahrscheinlich zu holen frühe Anzeichen von VL Rebounds und / oder das Fehlen von Compliance der Patienten in die Einnahme des Medikamentes ist.

Ein wesentliches Element einer koordinierten kostengünstige zentrale Service ist die Verfügbarkeit einer großen nationalen oder regionalen Netzwerk von Experten und wissenschaftlichen Beratern, die mit der technischen und medizinischen Aspekte des Betriebs unterstützt. Dies wird durch die Aktivitäten der südafrikanischen NHL-Netzwerk und die CD4-PLG.net Ausbildungsmaßnahmen ^{33, 36,} die Ermutigung, Bildung und Qualitätsbewertung sorgen für die kleineren Zentren, und diese können auch "Point-of-care"-Dienste unter Beweis gestellt.

Wichtig ist, dass die Operationen der mittel-und Point-of-Care-Labors ergänzen. Während erstere hat die doppelte Rolle der Bereitstellung einer kostengünstigen großflächigen Service-Betrieb sowie grundlegende / Weiterbildung für die peripheren Laboratorien ^33,38 trägt der letzteren um die Ausbreitung der ART durch die Rekrutierung von HIV + Patienten, die Anspruch auf sind zu überprüfen ART von einer breiteren Basis, einschließlich der ländlichen Kliniken. Hier einige Vorsicht ist notwendig, weil Point-of-Care-Diagnostik kann sehr viel teurer und garantieren nicht automatisch Genauigkeit ^38. Es ist daher sinnvoll, die Zwei-Klassen-System beibehalten und die Koordinierung zwischen den beiden Ebenen zu erleichtern, ohne dass entweder arm zu schwinden.

Abschließend, im Bereich der diagnostischen Überwachung der klinischen Behandlung von Infektionskrankheiten eine notwendige Kosteneinsparungen können durch apt-Dienste, die weniger teuer und besser koordinierte Einsatz moderner Technologie mit deutlich verbesserter Qualität ^13,39 erreicht werden. Gut organisierte nationalen (und regionalen) Diagnose-Service Bestimmungen sollten besser unterstützt von ^6-8 durch die Vermeidung eines Szenarios, wenn nahezu alle Zuschüsse auf teure und / oder unerprobten Methoden sobald verschwendet wird, da diese aus den reichen Ländern importiert werden, ohne eine sorgfältige Vor- vorbeugenden konstruktiven Kontrolle. Ebenso sollte eine flexiblere Gestaltung von klinischen Therapiestudien mit der vollen Einbeziehung der lokalen Ärzten und medizinischem Personal zur Reduzierung der unnötig häufigen und / oder zu ehrgeizig Labortests ³ führen. Diese Politik würde noch eine Chance zu einem besseren Ausnutzung des verfügbaren genaue diagnostische Ergebnisse in einer koordinierten klinischen / Labor Beurteilung von Patienten auf ART geben. Diese intelligenten Diagnostik könnte auch für die ressourcenarmen Ländern ⁸ in den Bereichen Tuberkulose und Leukämien mit einer vorhandenen vertraut durchflusszytometrischen Plattform ⁴⁰ ist Vorreiter.