Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

Summary

Betrouwbare methode voor zeer efficiënte

Abstract

De in vitro expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ionkanalen in gekweekte humane embryonale niercellen (HEK-293T) is een alomtegenwoordige onderzoeksstrategie. HEK-293T cellen moeten worden uitgeplaat op dekglaasjes bij laag genoeg dichtheid, zodat ze niet in contact met elkaar, om voor de elektrofysiologische opname mogelijk te maken zonder verstorende effecten als gevolg van contact met de aangrenzende cellen. Getransfecteerd kanalen moeten ook uitdrukken met een hoog rendement bij het plasmamembraan van whole-cell patch clamp-opname van aantoonbare stromen boven geluidsniveau. Heterologe ion kanalen vereisen vaak lange incubatieperiode bij 28 ° C na transfectie om adequate membraan expressie te bereiken, maar er zijn steeds meer verlies van cel-adhesie dekglaasje en membraan stabiliteit bij deze temperatuur. Om dit probleem te omzeilen, ontwikkelden we een optimale strategie om transfecteren en plaat HEK-293T cellen. Deze methode vereist dat de cellen worden getransfecteerd bij een relatief hoge confluentie, en geïncubeerd bij 28 ° C voor de verschillende incubatie periode post-transfectie zodat er passende ionkanaal eiwit expressie. Getransfecteerde cellen worden daarna uitgeplaat op dekglaasjes en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende enkele uren, die zorgt voor stijve cel gehechtheid aan de dekglaasjes en membraan restabilization. Cellen kunnen worden opgenomen kort na plateren, of kan worden overgedragen aan 28 ° C voor verdere incubatie. We vinden dat de eerste incubatie bij 28 ° C, na transfectie maar voor plating, is de sleutel voor de efficiënte expressie van heterologe ion kanalen die normaal gesproken niet goed te spreken over de plasmamembraan. Positief getransfecteerde, zijn gekweekte cellen geïdentificeerd door co-expressie eGFP of eGFP uiting van een bicistronische vector (bijv. pIRES2-EGFP) die de recombinante ionkanaal cDNA net stroomopwaarts van een interne ribosoom entry site en een eGFP coderende sequentie. Whole-cell patch clamp opname vereist gespecialiseerde apparatuur, plus het vervaardigen van gepolijste registrerende elektroden en L-vormige massa-elektroden van borosilicaatglas. Drug delivery van de farmacologie van ionen kanalen studie kan worden bereikt door direct micropipetting drugs in de opname gerecht, of door gebruik te maken microperfusion of zwaartekracht stroom systemen die een ononderbroken stromen van het geneesmiddel oplossing productie van meer dan opgenomen cellen.

Protocol

1. Cel Cultuur

1. Menselijke embryonale nier 293T-cellen (HEK-293T, Invitrogen) worden gekweekt in aanhanger monolagen in geventileerde 25cm ² kolven (behandelde weefsel cultuur, Cellstar, Greiner Bio-One) met 6 ml van Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM, Sigma Aldrich), aangevuld met 10 % v / v foetaal runder serum (FBS, Sigma Aldrich), 1% natrium pyruvaat, en 250 ug / ml penicilline / streptomycine bij 37 ° C met 5% CO _2).
   
   Cellen worden geïncubeerd in CO ₂ incubatoren (5% CO ₂₎ ingesteld op 37 ° C of 28 ° C. Alle werkzaamheden met cellen wordt uitgevoerd in een laminaire stroming kap.
   
   
2. Cellen zijn meestal twee-wekelijkse split, van ~ 90% confluentie, in een 1:08 verdunning op maandag, en 01:12 op donderdag. (Zie figuur 1 voor de beelden van de HEK-293T-cellen geplateerd op verschillende dichtheden)
3. Voor het splitsen, is de media verwijderd van kolven van de cellen door aspiratie, en cellen worden losgemaakt door het toepassen van 1 ml van trypsine (Sigma Aldrich) oplossing verwarmd tot 37 ° C om de omgekeerde kolf. De fles wordt vervolgens omgekeerd en zachtjes geschud met de hand zodanig dat de trypsine oplossing beweegt over de aangehechte cellen meerdere malen. De trypsine wordt dan snel verwijderd door aspiratie en 250 pi van trypsine is micropipetted in de kolf, die weer wiegde om de trypsine oplossing bewegen over de cellen.
4. Kolven worden vervolgens geïncubeerd in een CO ₂ incubator ingesteld op 37 ° C gedurende 3-5 minuten, en een pipet wordt gebruikt om de cellen te schorten 4 ml van de warme aangevuld DMEM. Onvolledige trypsine en ophanging zal leiden tot massa's van cellen en kan leiden tot cellen naar boven en groeien niet in de beoogde monolaag. Over-behandeling met trypsine kan beschadiging van de cellen.
5. Voor een 1:8 splitsing, voeg 500μL van zwevende cellen worden toegevoegd aan een nieuwe fles met 5.5ml van DMEM, voor een 1:12 split (zie figuur 1), 333μL van cellen worden toegevoegd aan een nieuwe fles met daarin 5.7mL van DMEM . Kolven worden voorzichtig gemengd vervolgens overgebracht naar een 37 ° C incubator. Tijdens de 3-4h incubatie bij 37 ° C na het splitsen de cellen zullen sediment en zich houden aan de kolf. De cellen in eerste instantie kijken rond, maar zal afvlakken en hebben extensies (pseudopodia) met stevigere bevestiging (Figuur 1).
   
   De cellen moeten groeien in een aanhanger monolaag op een voorspelbare manier. Moet cel-groei en het uiterlijk worden atypische of inconsistent, een slechte techniek of vervuiling (bacteriën / mycoplasma) te worden overwogen. De sleutel tot succesvolle weefselkweek is consistentie.
   
   

2. Transfectie van HEK-293T met recombinant ionkanaal cDNA

1. Hier worden cDNA's van verschillende ionenkanalen gekloneerd in de pIRES2-EGFP-plasmide (BD Biosciences Clontech), die het mogelijk maakt voor de identificatie van een positief getransfecteerde cellen via een verbeterde groen fluorescerend eiwit (eGFP) fluorescentie. De eGFP wordt geproduceerd in getransfecteerde cellen van hetzelfde transcript als de gekloonde insert cDNA, via vertaling gestart van een interne ribosoom entry plaats net stroomafwaarts van de insert cDNA en stroomopwaarts van de eGFP coderende sequentie (Figuur 2). Zie figuur 3 voor foto's van fluorescerende HEK-293T, positief getransfecteerd met calcium kanaal subeenheden in pIRES2-EGFP constructen.
2. Voorafgaand aan de transfectie, is een volledig confluente fles splitsen 01:04 in een nieuwe fles, en de cellen mogen hechten bij 37 ° C in een CO ₂ incubator voor 3-4 uur (zie figuur 1).
3. Na de cellen zijn verbonden, is een standaard calciumfosfaat transfectie-strategie (Cold Spring Harbor protocollen) gebruikt worden om constructen die ion-kanaal en accessoires subunit cDNA's in de HEK-cellen te introduceren. Typisch, een totaal van 12μg van DNA in 600 ul transfectie oplossing ISE gebruikt per fles / transfectie.
4. Na de transfectie oplossing gepipetteerd over de cellen druppelsgewijs, is de kolf geplaatst in een 37 ° C incubator gedurende de nacht.
5. Na transfectie, cellen worden zorgvuldig drie keer gewassen met warm media of fosfaat gebufferde zoutoplossing (4-5 ml) door pipetteren de wasoplossing in een omgekeerde kolf, dan langzaam draaien van de fles rechtop en het schommelen van de fles, zodat de wasoplossing beweegt over de cellen. Als dit niet zorgvuldig gebeurt de cellen kon ontkoppel en weinigen zullen worden gelaten na de drie wasstappen. De wash is nog twee keer herhaald, dan 6 ml media worden toegevoegd aan de kolf en het is geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 2 uur, vervolgens overgebracht naar een 28 ° C incubator.
6. Succesvolle transfectie van pIRES2-EGFP constructen kunnen worden bevestigd 1 tot 3 dagen na transfectie met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. Cellen die groen fluoresceren wanneer ze worden blootgesteld aan UV-licht positief-getransfecteerd en moet de heterologe ion-kanaal en eGFP eiwitten uit te drukken.

3. Plating getransfecteerde HEK293T cellen in voorbereiding op de elektrofysiologische opname

nt "> Verschillende ion kanalen te drukken met verschillende rendementen op het celmembraan van de HEK-cellen, en als zodanig, de rest van dit protocol vereist enige optimalisatie te maximaliseren kanaal oppervlakte-expressie waardoor een succesvolle elektrofysiologische opname. expressie van heterologe ion kanalen in HEK-cellen, vooral van die van niet-zoogdieren bronnen, aanwezig kunnen sommige uitdagingen, waaronder (1) grote eiwit maten die een lange tijd te vertalen en lokaliseren aan de plasma membraan (2) afwezigheid of verschillen van vouwen en richten motieven op het kanaal eiwit nodig in een zoogdier cellijn (3) verschillen in codongebruik frequenties van soort tot soort. Al deze factoren samen kunnen leiden tot een eis voor een lange incubatietijd bij 28 ° C, die effectief eiwitexpressie en oppervlakte-lokalisatie verzekert zonder celdeling (dat zou verdunnen uit de heterologe cDNA's en eiwitten). Helaas, incubatie gedurende langere periodes bij 28 ° C leidt tot cel-onthechting en slechte stabiliteit membraan waardoor elektrofysiologische opname moeilijk. We besloten met conventionele transfectie strategieën te wijzigen (beoordeeld in Thomas en Smart 2005) om de incubatie te minimaliseren bij 28 ° C voorafgaand aan de opname en naar de oppervlakte uitdrukking te maximaliseren. Onze methode vereist dat cellen worden getransfecteerd, geïncubeerd gedurende een periode van 3-7 dagen bij 28 ° C, dan cellen zijn vrijstaand door trypsinebehandeling en opnieuw uitgeplaat op dekglaasjes en geïncubeerd bij 37 ° C die membranen restabilizes en zorgt voor een sterke hechting van cellen op dekglaasjes. cellen zijn dan in staat om meteen worden opgenomen, of kan worden geïncubeerd voor extra tijd bij 28 ° C. We vinden het replating van cellen op dekglaasjes op dit later stadium in onze methode absoluut essentieel voor de productie van dekglaasjes met hoge aantallen van het kanaal-expressie, afzonderlijk bijgevoegd cellen.

We presenteren twee alternatieve strategieën, die we liever gebruiken voor ion kanalen en ionkanaal complexen die geen grote extracellulaire domeinen die kunnen kwetsbaar zijn voor trypsine spijsvertering (bijv. Cav3 voltage-gated calcium kanalen, Senatore en Spafford 2010), en een die we gebruiken voor ionkanalen die bevatten grote extracellulaire domeinen (bijv. L-type voltage-gated calcium kanalen en hun toebehoren subeenheden;. Senatore, et al. 2010).

1. 1. Cellen worden geïncubeerd bij 28 ° C voor 2-6 dagen om de celdeling te voorkomen en om voor de accumulatie van vertaalde eiwit. Deze incubatietijd dient empirisch te worden bepaald voor elk ion kanaal, omdat oppervlakte-expressie afhankelijk is van intrinsieke factoren die bepalen hoe de kanalen 'ontluikende mRNA en polypeptidesequenties interactie met de translationele machines en de secretieroute respectievelijk.
   2. Voorafgaand aan plating, cirkelvormige glazen dekglaasjes (Circles nr. 1 - 0,13 tot 0.17mm dik, formaat: 12 mm, Fisher Scientific Canada, Ottawa, Ontario) zijn bekleed met _{Poly-L-lysine} (Sigma) als instructies per fabrikant.
   3. Media is verwijderd door aspiratie van de getransfecteerde cellen, en 1 ml van 37 ° C trypsine-oplossing (Sigma) is micropipetted in een omgekeerde kolf (cell kant naar boven). De kolf wordt vervolgens voorzichtig omgekeerd om de verticale positie, zodat het trypsine te lopen over de cellen, en de kolf is dan weer omgekeerd, waarna de trypsine verwijderd door aspiratie. 250 pi van warm trypsine wordt dan direct toegevoegd over de cellen en de kolf wordt geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 3-5 minuten tot de cellen ontkoppel.
   4. Ondertussen zijn _{poly-L-lysine-gecoate} dekglaasjes geplaatst in 6mm cultuur gerechten (3-8 per gerecht) en 5 ml van de warme cultuur media wordt toegevoegd aan elk gerecht.
   5. Getrypsiniseerd cellen worden geresuspendeerd met 4 ml van de warme cultuur media door en neer te pipetteren ~ 6 keer, dan 250 500μL geresuspendeerde cellen micropipetted in de cultuur gerechten met dekglaasjes. Voorafgaand aan de toevoeging van cellen, is het topje van de micropipet gebruikt om naar beneden druk op de dekglaasjes ervoor te zorgen dat ze op de bodem van de schotel.
   6. De cellen worden vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 3 uur om hen in staat stellen zich te houden aan de dekglaasjes, en dan zijn ze overgebracht naar 28 ° C. Op dit punt, de cellen klaar zijn voor elektrofysiologische opname, die idealiter wordt uitgevoerd met gescheiden-ingeschreven cellen (Fig.3 toont getransfecteerde cellen voor en na plateren op dekglaasjes). Het verlaten van de cellen te lang bij 37 ° C zal resulteren in de celdeling.
2. 1. Voorbereiding van de cellen die kanalen / kanaal-complexen met grote extracellulaire domeinen wordt uitgevoerd in vrijwel dezelfde manier zoals hierboven aangegeven, met de uitzondering dat dekglaasjes worden geïncubeerd bij 28 ° C voor een extra 2-4 dagen voordat elektrofysiologische opname is uitgevoerd. Dit zorgt voor een re-accumulatie van kanalen / channel complexes op het celmembraan na behandeling met trypsine.

4. Elektrofysiologische opname van recombinant kanalen in HEK-293T-cellen

Een aantal uitgebreide middelen beschikbaar zijn die beschrijven de algemene begrippen die ten grondslag liggen elektrofysiologische opname (bv. Ogden en Stanfield 1987; Molleman 2003).

4.1 Elektrofysiologie rig

Een typische elektrofysiologie rig (figuur 4) bestaat uit een versterker (bijvoorbeeld Axopatch 200B of 700B versterker Multiclamp, Axon Instruments, Union City, CA), een PC-computer is uitgerust met een Digidata 1440A analoog-naar-digitaal converter interface in combinatie met pClamp10.1 software (Molecular Devices, Sunnyvale, California), gemotoriseerde, dubbele pipet manipulators (MPC-385-2, Sutter Instrument Company), een epifluorescentiemicroscoop (Axiovert 40 CFL, Zeiss Canada, Toronto, Ontario) en perfusie systemen (figuren 4 en 5 ). Trillingen worden beperkt door de montage van de apparatuur op een TMC-63-500 serie trillingsisolatie tafel (Technische Manufacturing Corporation, Peabody. MA). Stray elektrische ruis wordt beperkt met behulp van een 40 "tall Type II Kooi van Faraday (TMC) rond de elektrische apparatuur gemonteerd op de trillingsisolerende tafel. Elektronische controlesystemen (zoals computer en monitor, versterker, analoog-naar-digitaal converter, gemotoriseerde manipulator en Valvelink perfusie systeem) worden gemonteerd buiten de kooi van Faraday om een ​​vrijstaande metalen elektrische rack (Hammond Manufacturing, Guelph Ontario). Alle elektrische apparatuur geaard is om een ​​koper distributeur en aangesloten op een Medical Grade Isolatie transformator (1800W, Tripp Lite UL60601-1) welke lijn isolatie, een consistente grond-en overspanningsbeveiliging biedt.

4.2 Patch pipetten

Borosilicaatglas capillairen met gloeidraad (OD 1.5mm, 0.86mm OD, 15cm lengte, BF150-86-15; Sutter Instrument Company) zijn in tweeën gesneden en ingebracht in een Flaming / Bruin Micropipet Puller Model P-97 (Sutter Instrument Company) . Een pipet-trekker programma is geoptimaliseerd om consequent te genereren pipetten met weerstanden tussen de 2 tot en met 5MΩ van elektrode naar de grond (na brand polijsten; Fig.6) Pipettes zijn individueel brand gepolijst om de pipetpunt oppervlakken die het mogelijk maakt voor afdichtingen tegen celmembranen soepel ( Micro Forge MF-830, Narishige, Japan, Figuur 6). Micropipetten zijn gemonteerd op de headstage met een gespecialiseerde houder (1-HL-U; Molecular Devices, Sunnyvale in Californië).

4,3 massa-elektroden

De borosilicaat glazen buizen gebruikt om pleister pipetten te maken worden ook gebruikt om te verwijzen elektroden te maken. De 15cm lange buizen worden gesneden in drie stukken. Met twee fijne punt pincet, worden de buizen gehouden in een bunsenbrander vlam tot het glas wordt kneedbaar en de slang kan worden gebogen om een ​​"L" of "hockey stick" vorm met een 90o hoek. Terwijl de glazen buizen zijn nog steeds heet, is een einde onmiddellijk ondergedompeld in een warme 3M CsCl en 1,5% agarose oplossing te vinden die in de buis getrokken door capillaire werking. Zodra een referentie-elektrode wordt volledig gevuld met de oplossing, wordt het geplaatst in een bekerglas met koud water. Nadat alle van de referentie-elektroden worden gevuld, worden ze individueel afgeveegd met Kimwipes om extra agarose te verwijderen van de buitenkant en worden ondergedompeld in een 3M CsCl oplossing. Voor de elektrofysiologische opname, worden de referentie-elektroden die in een micro-elektrode houder Half-Cells (Holder 90 F Pellet 1.5mm, # MEH3RF15; Wereld Precision Instruments Inc, Sarasota Florida) gevuld met 3M CsCl oplossing. (Zie figuur 7 voor illustratie van een aardelektrode in bad oplossing)

4.4 Elektrofysiologie recording oplossingen

Verschillende soorten van voltage-gated ionkanalen vereisen verschillende opname-oplossingen, afhankelijk van ion permeabiliteit / selectiviteit. Voor de voltage-gated calcium kanalen, worden de cellen meestal badend in externe oplossingen die zowel barium of calcium in verschillende concentraties. Zo kan bijvoorbeeld elektrofysiologische opname van de ongewervelde Cav3 voltage-gated calcium kanaal (LCav3) worden uitgevoerd met behulp van een externe oplossing die 5mM CaCl _2, 166mM tetraethylammonium (TEA-Cl), 10 mM HEPES met een pH ingesteld op 7,4 met de TEA-OH. Patch pipetten zijn gevuld met een interne oplossing van 125 mm CsCl, 10mm EGTA, 2mm _CaCl2, 1 mM _MgCl2, 4mm MgATP, 0,3 mm Tris-GTP, en 10mm HEPES met een pH van 7,2 (Senatore en Spafford, 2010). De ongewervelde L-type voltage-gated calcium-kanaal (LCav1) kunnen worden geregistreerd met behulp van een externe oplossing die barium als de ladingsdrager (15mm BaCl2, 1 mM _MgCl2, 10 mM HEPES, 40mm TEA-Cl, 72,5 mm CsCl, 10mm Glucose, met de pH ingesteld op 7,2 met de TEA-OH) en een interne oplossing die 108mm Cs-methaansulfonaat, 4mm MgCl _2, 9mm EGTA, 9mm HEPES, pH ingesteld op 7,2 met CsOH (Senatore et al.., 2010).

4.5 Whole Cell opnemen

1. Een dekglaasje die getransfecteerde cellen bevatten (heterologe expressie ion-kanalen of ionkanaal complexen) wordt overgebracht naar een 35mm plastic petrischaaltje met ~ 3 ml van externe recording oplossing. Het volume van de opname-oplossing moet nauwkeurig worden gemeten bij het uitvoeren van drugs experimenten waarbij bekende hoeveelheden van het geneesmiddel te worden toegevoegd aan het gerecht met een micropipet. Elektrofysiologische opnames worden meestal uitgevoerd bij kamertemperatuur, hoewel de onderzoeker kunt deze temperatuur te veranderen, afhankelijk van het experiment.
2. Cellen worden gevisualiseerd door middel van een epifluorescentiemicroscoop en een geïsoleerd, positief-getransfecteerd, zich hechtende groene cel is gecentreerd in het midden van het gezichtsveld.
3. De patch pipet wordt neergelaten in het bad oplossing om met een micromanipulator, die het circuit compleet tussen de elektrode in de patch pipet en de referentie-elektrode. Terwijl in bad mode, de pClamp10.1 software zorgt ervoor dat de versterker te genereren kleine herhalen spanning stappen tussen de pipet en de referentie-elektrode, en geeft de resulterende stroom als een blokgolf trace (Figuur 8A). Deze blokgolf spoor moet op nul worden gezet met behulp van de pipet offset van de versterker voor het patchen van een cel. De pipet weerstand wordt gemeten door de pClamp10.1 software, en moet binnen 2-5MΩ.
4. Terwijl in bad mode, de pipet wordt gebracht in de nabijheid van de cel, die kan worden gevisualiseerd als een snelle fluctuaties in de blokgolf te sporen, dan is een kleine hoeveelheid zuigkracht wordt toegepast om de patch pipet aan op een gigaohm afdichting tussen de pipet en vorm het membraan (oorzaken een complete flat-lijn van de blokgolf te achterhalen; Figuur 8B).
5. Het programma wordt nu in patch mode, en pipet capaciteit (zichtbaar als kleine blips van stroom op de voor-en achterrand van de flat huidige trace; Figuur 8B) wordt gecompenseerd met de pipet capaciteit vergoeding op de versterker.
6. Een kleine maar scherpe hoeveelheid zuigkracht wordt toegepast op breuk het membraan in de patch en laat de toegang van de elektrode aan de binnenkant van de cel. Succesvolle membraan breuk wordt aangegeven door het verschijnen van grote capacitieve overgangen ook op de voor-en achterrand van de huidige golf trace (Figuur 8C). Zodra doorbreken is bereikt, het programma is overgeschakeld naar cel-modus en hele celcapaciteit vergoeding is aangepast op de versterker naar de capacitieve transiënten te verwijderen. Er is een vertraging van een paar minuten te zorgen voor evenwicht van de intracellulaire opname oplossing in de cel voorafgaand aan de opname.
7. Spanning commando's worden gegenereerd en de gegevens wordt verkregen met behulp van een computer die uitgerust is met een Digidata 1440A analoog-naar-digitaal converter interface in combinatie met pClamp10.1 software. Unieke voltage clamp protocollen zijn geschreven voor elk experiment, en deze worden gebruikt voor het ionkanaal stromen van getransfecteerde cellen op te nemen. Figuur 9 illustreert calcium stromen opgenomen met een HEK-293T-cel die de ongewervelde LCav3 voltage-gated calcium kanaal. De cel werd gehouden bij een spanning van-110mV, en incrementele depolarisaties tussen-70mV en +20 mV werden genomen om naar binnen te lokken calcium stromen.
8. Opgenomen stromingen worden gefilterd op 10 kHz met behulp van een low-pass Bessel-filter en gedigitaliseerd in een sampling frequentie van 2 kHz. Alleen opnames met minimale lek (<10%) worden gebruikt voor analyse, en offline lek aftrekken wordt uitgevoerd met behulp van de Clampfit 10,1 software.

4.6 Drug studies van de opgenomen cellen

Medicijnen kunnen direct worden gepipetteerd in de schotel wordt opgenomen. Concentratie van drugs kan worden berekend als het volume van geneesmiddelen toegevoegd en het volume van het bad oplossing zijn bekend. Dure of beperkte hoeveelheden van het geneesmiddel kan ook worden toegevoegd door microperfusion van een multi-vat manifold polyimide perfusie potlood met een 250 micron afneembare tip, met behulp van een acht kanaals Smartsquirt druk micro-perfusie-systeem (AutoMate Scientific) of zwaartekracht systeem van kleppen door middel van Teflon en Valvelink8 klep controllers (AutoMate Scientific, zie Figuur 5 voor perfusie-systeem setups). Debiet van microperfusion systemen worden vastgesteld op 0,1 ml per minuut in een stroom het verlaten van de perfusie potlood 400 micron uit de opgenomen cel. De afstand van de perfusie potlood tip van de registratie-elektrode tip moeten in overeenstemming zijn van de patch te patchen; Figuur 10 illustreert een gesuggereerd afstand zichtbaar 40x vergroting. Voldoende debiet geven verzadigen perfusie van de opgenomen cel. Voordat een medicijn experiment wordt uitgevoerd met behulp van microperfusion, cellen worden in evenwicht gebracht met de microperfusion van controle bad-oplossing in een continue stroom. Een minimale onderbreking van de stroom is vermeden te worden tijdens het experiment door de snelle omschakeling van de controle bad, drugs of wasoplossing. Afzuiging gemonteerd aan de rand van de opname schaal kan worden gebruikt to verwijderen overloop van oplossingen, door middel van handmatige zuigkracht met een spuit of met behulp van een peristaltische pomp aangedreven apparaat (bijv. MINISTAR Miniature DC peristaltische pomp, World precisie-instrumenten). Zorg moet worden genomen, omdat een extreem snelle perfusie induceert shear krachten die de huidige calcium kan veranderen (Peng et al.. 2005), kan wegspoelen de cel wordt opgenomen, en put het medicijn reservoir te snel.

Rechtstreeks pipetteren in de schaal versus perfusie-systemen

	Direct pipetteren	Micro-perfusie-systeem	Zwaartekracht perfusie-systeem
Volume drug nodig	Matig	Laag	Hoog
Technische vaardigheden	Laag	Medium	Medium
Apparatuur kosten	Laag	Significante	Significante
Dagelijks Tijd om te installeren en opruimen	Geen	20 + minuten	20 + minuten
Verontreiniging van de apparatuur	Geen	Ja	Ja
Het oplossen van problemen	Gemakkelijk	Complex	Complex
Gegarandeerde drug in schotel	Ja	Geen	Geen
Verliezen cel met drugsverslaving	Ja	Ja	Ja
Sterk verminderen drug conc. door het wassen	Moeilijk	Eenvoudig	Eenvoudig
Het gemak van het doen van een meervoudige dosis-respons-curve	Minder dan optimaal	Eenvoudig	Eenvoudig
Reproduceerbaarheid van de resultaten	OK - afhankelijk van de locatie van pippeting	Goed	Goed

Discussion

In staat zijn om whole-cell stromen met behulp van de beschreven protocollen en oplossingen record geeft aan dat de transfectie succesvol was en dat het gewenste voltage-gated ion kanalen of ionkanaal complexen aanwezig zijn met aanzienlijke hoeveelheden op het celmembraan. Indien de cellen die positief worden getransfecteerd (dat wil zeggen fluorescerend groen) maar geen recordable stromingen, extra tijd bij 28 ° C kan nodig zijn om het kanaal eiwit goed worden verpakt en ingevoegd in de celmembraan. Merk op dat langdurige incubatie bij 28 ° C zorgt ervoor dat cellen los te maken van de dekglaasjes, en membranen te destabiliseren en vuil ophopen van dode cellen, waardoor patch clamp opnamen meer uitdagend. Alle tijden voorgesteld in dit protocol zijn geoptimaliseerd voor onze eigen kanalen. Andere kanalen en hun subeenheden kan het langer of korter incubatietijden, en onze protocol kan verder worden aangepast zoveel als nodig. Voor bepaalde kanalen slechte transfectie-efficiëntie (dwz minder fluorescerende cellen en lagere fluorescentie-intensiteit per cel) produceert betere resultaten dan efficiënt getransfecteerd, sterk fluorescerende cellen. Mocht cellen fluorescent, maar niet opneembaar stromingen, het oplossen van problemen punten te beschouwen, omvatten: een gebrek aan proteïne accessoire (s), onjuist mengen van transfectiereagentia, sub-optimale recording oplossingen, en mutatie / recombinatie van kanaal of kanaal subeenheid cDNA constructen produceren onjuist gevouwen of niet uiten van kanalen.

Figuur 1: Menselijke embryonale nier 293T-cellen (HEK-293T) worden geteeld in aanhanger monolagen bij 37 ° C in CO2-incubatoren (5% CO2) in geventileerde 25cm2 kolven tot 90% confluentie en split op 1:12, 1:08 en 1:04 verdunningen. Cellen zijn meestal twee-wekelijkse splitsen, van een ~ 90% confluentie. Om ervoor te zorgen een soortgelijke ~ 90% confluentie op te splitsen, worden de cellen gesplitst in een 1:08 verdunning op maandag, en 01:12 op donderdag. Voorafgaand aan de transfectie, is een volledig confluente fles splitsen 01:04 in een nieuwe fles, en de cellen mogen bij 37 ° C hechten in een CO2-incubator voor 3-4 uur.

Figuur 2: Strategie voor heterologe expressie van ionenkanalen in HEK-293T (links) ion channel cDNA's worden gekloneerd in de meervoudige kloneringsplaats van de pIRES2-EGFP-plasmide.. (Rechts) Transfectie van deze constructen in de HEK-cellen resulteert in de productie van mRNA-moleculen die het ionkanaal coderende sequentie (rood) net stroomopwaarts van een interne ribosoom entry site (IRES, blauw) en de eGFP coderende sequentie (groen). Ionenkanalen worden vertaald en geschuif met het celmembraan via de ER en endomembraan systeem, terwijl eGFP is vertaald en bewaard in het cytoplasma.

Figuur 3:. Transfectie en expressie van heterologe ionkanaal cDNA's in HEK-293T-cellen, en beplating van de cellen op dekglaasjes voor elektrofysiologische opname (A) (Top panelen) HEK-293T cellen geïncubeerd bij 28 C, vier dagen na transfectie met de LCav3 calciumkanalen koesterde in de pIRES2-EGFP zoogdieren CMV expressievector. (Onderste panelen) Het bovenstaande cellen getrypsiniseerd en uitgeplaat op glas dekglaasjes, geïsoleerd elektrofysiologische opname. Differentieel interferentie contrast microscopie (DIC).

Figuur 4:. Een typische elektrofysiologische opname rig setup Electrofysiologische opname rig componenten zijn onder meer een versterker (A), een personal computer (PC), Digidata 1440A analoog-naar-digitaal converter interface (C), gemotoriseerde, dubbele pipet manipulators (PM), een epifluorescentiemicroscoop (M), perfusie systemen (P), TMC 63-500 serie trillingsisolatie tabel (VT), 40 hoog type II Kooi van Faraday (FC), en een vrijstaande 19 metalen, elektrische rack (R).

Figuur 5: Perfusie systemen (A) Een zwaartekracht systeem bediend met Teflon kleppen en Valvelink8 controllers.. (B) Achtkanaals Smartsquirt druk micro-perfusie-systeem. Multi-Vat Manifold Tip van een van beide perfusie-systeem is gemonteerd op een gemotoriseerde manipulator.

Figuur 6:. Gepolijst, pleister pipetten getoond 10x (links) en 40x (rechts) vergroting Patch pipetten werden gegenereerd uit borosilicaatglas capillairen met gloeidraad en vuur gepolijst om de pipetpunt oppervlak glad. Een pipet-trekker-programma werd geoptimaliseerd om pipetten die een lezing van twee-5MΩ gaf in onze elektrofysiologie set-up te genereren.

2314fig7.jpg "alt =" figuur 7 "/>
. Figuur 7: Begane elektrode en patch pipetten in de opname schaal patch pipet (rechts) en massa-elektrode (links, witte pijl) in de opname oplossing.

Figuur 8:. PClamp10.1 screen shots ter illustratie van de stappen van het maken van een patch (A) Vierkant golf te sporen waargenomen wanneer in bad mode. (B) Een Gigaohm afdichting in patch mode leidt tot een afvlakking van de blokgolf trace met pipet capaciteit zichtbaar als kleine blips van stroom op de voor-en achterrand van de flat huidige trace. (C) Na doorbraak en terwijl in cel-modus, zijn grote capacitieve passanten gezien.

Figuur 9:. Elektrofysiologie resultaten (links) Recordable naar binnen voltage-gated calcium stromen geeft succesvolle transfectie en expressie van heterologe ion kanalen (bijv. LCav3). (Rechts) ongetransfecteerde cellen hebben geen opneembare stroming. Cellen werden onderworpen aan een IV-protocol, dat bepaalt dat de software dan de cel aan-110mV te houden en stap naar-70mV voor 250msec dan terug naar beneden to-110mV holding potentieel. Elke keer dat de stap toe met 10mV, zodat de stappen zijn voor-70mV,-60mV etc. tot de laatste stap is tot +20 mV. Resultaten zijn voor een ongewervelde T-type (Cav3) voltage-gated calciumantagonisten homoloog van L. stagnalis genoemd LCav3.

Figuur 10: Opstelling van de elektroden en microperfusion potlood in de opname-oplossing (A) Patch pipetten vervaardigd uit borosilicaatglas (rechts) en polyimide multi-vat manifold tip voor drugs-perfusie (links).. Aardelektrode (achterkant) van borosilicaatglas gevuld met 3M CsCl en 1,5% agarose-oplossing gebogen als hockeystick gehouden in micro-elektrode houder Half-cellen. (B) 40x bekijken door een microscoop van de perfusie potlood tip en het opnemen van micro-elektrode.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pIRES2-EGFP plasmid	Clontech Laboratories	6029-1
Circle glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-80	Circles No. 1 - 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm
Amplifier	Axon Instruments	Axopatch 200B or Multiclamp 700B
Data Acquisition System	Axon Instruments	Digidata 1440A
Electrophysiology Software	Axon Instruments	pClamp10.1
Pipette manipulators	Sutter Instrument Co.	MPC-385-2
Epifluorescence inverted microscope	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 40 CFL
Headstage	Axon Instruments	CV-7B
Headstage electrode holder	Axon Instruments	1-HL-U
Micr–lectrode holder for ground electrode	World Precision Instruments, Inc.	MEH3RF 15
Electrophysiology capillary tubes	Sutter Instrument Co.	BF-150-86-15	Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Micropipette fire polisher	Narishige International	Micro Forge MF-830
Micro drug perfusion system	AutoMate Scientific, Inc.	SmartSquirt8 Valvelink8.2
Drug perfusion system	AutoMate Scientific, Inc.	Valvelink8.2 with Teflon valves