Summary
高効率、信頼性の高い方法
Abstract
in vitro発現と培養ヒト胚性腎細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録（HEK - 293T） におけるユビキタス研究の戦略です。彼らは、隣接セルとの接触による交絡影響することなく電気生理学的記録を可能にするために、互いに接触していないようにHEK - 293T細胞は、十分に低い密度でカバーガラス上にプレーティングする必要があります。トランスフェクトされたチャネルは、ノイズレベルを超える検出可能な電流の細胞全体のパッチクランプ記録のための細胞膜に高効率で表現しなければなりません。異種イオンチャネルは、多くの場合、十分な膜発現を達成するために28℃でトランスフェクション後にCを長い潜伏期間が必要ですが、この温度で細胞カバースリップの接着と細胞膜の安定性の損失が高まっている。この問題を回避するために、我々は、トランスフェクションとプレートHEK - 293T細胞に最適化された戦略を開発した。このメソッドは、セルが28で比較的高いコンフルエントでトランスフェクトされた、とインキュベートされている必要があります°十分なイオンチャネルタンパク質の発現を可能にするために潜伏期間後のトランスフェクションを変えるためのC。トランスフェクトした細胞をガラスカバースリップ上に播種し、37℃でカバーガラスと膜のrestabilizationに硬い細胞接着を可能にするいくつかの時間、インキュベートする。細胞はすぐにメッキの後に記録することができます、または° C、さらにインキュベーションを28に転送することができます。我々は28時の初期インキュベーション℃で、トランスフェクション後、メッキの前には、通常は細胞膜でも発現しない異種イオンチャネルの効率的な発現のための鍵であることがわかります。積極的にトランスフェクション、培養細胞は、単に上流の内部リボソーム侵入部位およびEGFPをコードする配列のcDNA組換えイオンチャネルを含むバイシストロンベクター（例えばpIRES2 - EGFP）から発現共発現EGFPまたはeGFPので識別されます。ホールセルパッチクランプ記録は、特殊な装置を必要とする、加えて洗練された記録電極とホウケイ酸ガラスからL字型の接地電極の策定。イオンチャネルの薬理学を研究する薬物送達は、直接録音皿に薬をmicropipettingことにより、またはmicroperfusionまたは記録された細胞を介して薬液の中断のないストリームを生成する重力流システムを使用することによって達成することができます。
Protocol
1。細胞の文化
- 10で補足した。ダルベッコ改変イーグル培地（シグマアルドリッチDMEM）の6mLを含むヒト胚性腎臓293T細胞（HEK - 293T、Invitrogen社）ベント25センチメートル2フラスコ（グライナーバイオワン; Cellstar扱わ組織培養）で接着単層で増殖させる％（v / v）のウシ胎児血清（FBS;シグマアルドリッチ）、1％ピルビン酸ナトリウム、および37で250μg/ mLのペニシリン/ストレプトマイシン° Cで5％CO 2）。
細胞は、いずれの37℃または28℃に設定したCO 2インキュベーター（5％CO 2）でインキュベートする細胞を持つすべての作業は、層流フード内で行われます。 - 細胞は通常、月曜日は1:8の希釈で、〜90％コンフルエントから、隔週分割、および木曜日午前1時12分されています。 （異なる密度で播種したHEK - 293T細胞の画像については、図1を参照）
- 分割の場合、メディアは、吸引によって細胞のフラスコから除去され、そして細胞は、° C倒立フラスコに37に加熱トリプシン（シグマアルドリッチ）ソリューション液1mLを適用することによって分離されます。フラスコを手で、その後反転し、緩やかに揺り動かしているトリプシン溶液で数回接続されたセルの上に移動するように。トリプシンは、その後速やかに吸引除去され、トリプシンの250μLのは、再び細胞上のトリプシン溶液を移動させる揺動されるフラスコにmicropipettedています。
- フラスコは、CO 2インキュベーター中でインキュベートする37℃に設定さ3-5分のためのC、及びピペットは暖かいDMEM培地の4mlの中で細胞を停止するために使用されます。不完全なトリプシン処理し、懸濁液を、細胞の塊が発生し、細胞が意図した単層で上向きにしていない成長する可能性があります。オーバートリプシン処理は細胞を損傷する恐れがあります。
- 1:8分割の場合、浮遊細胞の500μLのDMEM 5.5mLを含む新しいフラスコに添加されているを追加します。1時12分割のために（図1を参照）、細胞の333μLをDMEMの5.7mLを含む新しいフラスコに添加されています。フラスコを穏やかに37℃のインキュベーターに転送して混合される。 37 3 - 4Hインキュベートした分割後のCの間に、細胞が沈殿し、フラスコに付着する。細胞は最初にラウンドに見えますが、しっかりしたアタッチメント（図1）で拡張子（偽足）を平らにし、必要があります。
細胞は、予測可能な方法で接着単層で生育してください。細胞増殖および外観は、非定型または一貫性のない、貧しい人々の技術や汚染（細菌/マイコプラズマ）考慮すべきでなければならない。成功した組織培養への鍵は一貫性です。
2。組換えイオンチャネルcDNAをHEK - 293Tのトランスフェクション
- ここでは、様々なイオンチャネルからのcDNAが強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）蛍光を経由して積極的にトランスフェクションされた細胞の同定を可能にするプラスミドpIRES2 - EGFP（BDバイオサイエンスクロンテック）にクローニングされています。 EGFPはすぐ下流のcDNAおよびEGFPをコードする配列（図2）の上流に挿入の内部リボソーム侵入部位で開始した翻訳を通じて、cDNAをクローニングしたインサート、同じ転写産物からのトランスフェクションした細胞で生産されている。積極的にpIRES2 - EGFPコンストラクトのカルシウムチャネルサブユニットをトランスフェクトした、蛍光HEK - 293Tの画像については、図3を参照してください。
- 前のトランスフェクションに、完全にコンフルエントフラスコは、新しいフラスコに1:4に分割され、そして細胞を37での接続を許可されています° CをCO 2インキュベーターで3〜4時間のために（図1を参照）。
- セルが接続された後、標準のリン酸カルシウムトランスフェクションの戦略（コールドスプリングハーバープロトコル）はHEK細胞へのイオンチャネルとアクセサリーサブユニットのcDNAを含むコンストラクトを導入するために使用されます。一般的に、フラスコ/トランスフェクションごとに使用されるトランスフェクション溶液のISEの600μLのDNAの12μgの合計。
- トランスフェクション液を細胞滴以上のピペッティングした後、フラスコを一晩37℃のインキュベータ内に配置されます。
- 以下のトランスフェクションは、細胞は慎重にして徐々に上のように洗浄溶液の移動を直立フラスコを回して、フラスコを揺らし、倒立フラスコに洗浄溶液をピペッティングすることにより（4-5 mL）を緩衝生理食塩水暖かいメディアまたはリン酸で3回洗浄する細胞。これは注意深く行われていない細胞がデタッチ可能性があり、いくつかは、次の3つの洗浄ステップの後に残される。洗浄は、メディアの6mlの後、さらに2回繰り返され、フラスコに添加し、それを37でインキュベートされた℃で2時間のためのCを、その後28に転送℃のインキュベーターが。
- pIRES2 - EGFPコンストラクトの成功したトランスフェクションは、1〜3日落射蛍光顕微鏡を用いてトランスフェクション後に確認することができます。紫外線にさらされると緑色の蛍光を発する細胞が積極的にトランスフェクトされ、異種のイオンチャネルとEGFPタンパク質を発現してください。
3。メッキは、電気生理学的記録に備えてHEK293T細胞をトランスフェクト
NT">異なるイオンチャネルは、HEK細胞の細胞膜において異なる効率で発現し、そのようなものとして、このプロトコルの残りの部分は成功し電気生理学的記録を可能にするチャネルの表面発現を最大にするために、いくつかの最適化が必要です。HEK細胞における異種イオンチャネルの発現、特に非哺乳動物源からのものの、（1）長い時間を必要とする大規模なタンパク質のサイズは、変換と形質膜（2）不在または哺乳類に必要なチャネルタンパク質でモチーフを折り曲げるとターゲットの類似度にローカライズするを含むいくつかの課題を提示することが細胞株（3）種から種へのコドン使用頻度の違い。組み合わせてこれらすべての要因が28で長いインキュベーション時間のための要件が発生すること·セルの分裂せずに効果的なタンパク質発現と表面局在を確保（外希釈だろうれるC、異種cDNAおよびタンパク質）。残念ながら、28で長時間のインキュベーション° Cは、細胞の剥離と電気生理学的記録が困難に乏しい膜の安定性につながります。私たちは、インキュベーションを最小限にするために（トーマスとSmart、2005年にレビュー）従来のトランスフェクションの戦略を変更することを決定28℃で前に録音すると表面発現を最大にする。提案手法は、細胞を28に3-7日の期間インキュベート、トランスフェクションされている必要があります° C、その後、細胞をトリプシン処理によって切り離さとカバースリップの上に色を保ち続けると37℃でインキュベートされています°膜をrestabilizesとカバースリップ上の細胞の強力な付着を可能にする。細胞は、その後すぐに記録することができる、または28で時間の追加の期間インキュベートすることができます℃まで我々は、この後の段階でカバースリップ上の細胞の再播種を見つけるCチャネル発現の高い番号、別の付着細胞とカバーグラスを製造するために必要不可欠であることが私たちの方法では我々は2つの代替戦略、我々はイオンチャネルおよびトリプシン消化（例えばCav3電位依存性カルシウムチャネル、Senatoreとスパッフォード2010）に対して脆弱である可能性のある大きな細胞外ドメインが含まれていないイオンチャネル複合体に使用することを好むものを提示する、一我々は大きな細胞外ドメインが含まれて行うイオンチャネルのために使用すること（例えば、L -型電位依存性カルシウムチャネルとその付属品のサブユニット;。Senatore、ら 2010）。
- 細胞を28℃で細胞分裂を防ぐため、翻訳されたタンパク質の蓄積を可能にするために2-6日間インキュベートされています。表面発現は、チャンネル"新生mRNAとポリペプチド配列はそれぞれ、翻訳機構と分泌経路と相互作用する方法を指示本質的な要因に依存しているので、このインキュベーション時間は、各イオンチャネルのために経験的に決定する必要があります。
- プレーティング前に、円形のガラス製カバースリップ（サークル1号-厚さ0.17ミリメートル〜0.13、サイズ：12ミリメートル、フィッシャーサイエンティフィックカナダ、オタワ、オンタリオ州）があたり、メーカーの指示として、ポリ- L -リジン（Sigma）でコーティングされている。
- メディアは、トランスフェクションされた細胞から吸引除去され、37の1 mLを° Cトリプシン溶液（シグマ社製）倒立フラスコ（アップセル側）にmicropipettedています。フラスコを穏やかにトリプシンは細胞上で実行できるように直立位置に反転され、そしてフラスコを再び反転し、トリプシンを吸引によって除去される。暖かいトリプシンの250μLは、直接セルに追加され、フラスコは細胞のデタッチされるまで3〜5分間37℃でインキュベートする。
- 一方、ポリ- L -リジンコートしたカバースリップは、6ミリメートル培養皿（シャーレ当たり3-8）に配置され、暖かい培地5mLをそれぞれの皿に追加されます。
- トリプシン処理細胞はピペッティングによって暖かい培地の4mlのに再懸濁する〜6回、その後再懸濁した細胞の250 -500μLカバースリップを含む培養皿にmicropipettedされています。細胞を添加する前に、マイクロピペットの先端は、彼らは皿の底にあることを保証するためにカバースリップを下にプッシュするために使用されます。
- 次に、細胞を3時間℃で、それらをカバーガラスに付着するように37℃でインキュベートし、そしてそれらが28℃に転送されます。この時点で、細胞は理想的に別個に接続された細胞（図3は、カバースリップの上にメッキする前と後にトランスフェクトされた細胞を示す）で行われる電気生理学的記録、のための準備が整いました。 37長すぎるために細胞を残すことは° Cは、細胞分裂になります。
- 大きな細胞外ドメインとチャネル/チャネル複合体を発現する細胞の調製は、カバーグラスを28℃でインキュベートされることを除い°電気生理学的記録が行われる前に、追加の2-4日間のためのCと、上記のようにほぼ同じ方法で実施される。これは、チャネル/チャネルCの再蓄積を可能にトリプシン処理後の細胞膜でomplexes。
4。 HEK - 293T細胞における組換えチャンネルの電気生理学的記録
いくつかの包括的なリソース電気生理学的記録の基礎となる一般的な概念を説明する（例えば、オグデンとスタンフィールド1987; Molleman 2003）ことが可能です。
4.1電気生理学リグ
、Digidata 1440A pClamp10.1と一緒にアナログ - デジタルコンバータのインターフェースを搭載したPCのコンピュータ、典型的な電気生理学的リグ（図4）アンプ（アクソンインスツルメンツ、ユニオンシティ、カリフォルニア州などAxopatch 200Bまたは700BアンプをMulticlamp）が含まれていますソフトウェア（Molecular Devices社、サニーベール、カリフォルニア州）、電動、デュアルピペットマニピュレータ（MPC - 385 - 2、サター器械公司）、落射蛍光顕微鏡（Axiovert 40 CFL、ツァイスカナダ、トロント、オンタリオ州）と血流のシステム（図4と図5 ）。振動はTMC 63から500シリーズの防振台（テクニカルマニュファクチャリング株式会社、ピーボディ。MA）に機器を取り付けることにより制限されています。浮遊電気的ノイズは、防振台に搭載された電気機器を取り巻く40"背の高いタイプIIファラデーケージ（TMC）を使用して制限されています。電子制御システム（コンピュータ＆モニター、アンプ、アナログ - デジタルコンバータ、電動マニピュレータとのようなValvelink潅流コントロールシステム）、自立型金属電気ラック（ハモンドマニュファクチャリング、エルフオンタリオ州）へのファラデーケージの外側に取り付けられています。すべての電気機器は、銅の代理店に接地し、メディカルグレードのアイソレーショントランスを（1800W、トリップLiteに接続されている線の分離、一貫性のある地上及びサージ抑制を提供するUL60601 - 1）。
4.2パッチピペット
フィラメント（; BF150 - 86 - 15; 1.5ミリメートルOD、OD 0.86ミリメートル、15センチメートル長サター器械公司）とホウケイ酸ガラス毛細管を半分にカットし、フレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーモデルP - 97（サター器械公司）に挿入されます。 （ピペットを個別の細胞膜に対するタイトなシールを可能にするピペットチップの表面を滑らかに磨かれた発射され、ピペットプラープログラムは一貫して地面に電極から2〜5MΩ（図6火災の研磨後）の間に抵抗を持つピペットを生成するために最適化されていますマイクロフォージMF - 830、成茂、日本、図6）。マイクロピペットは、特殊なホルダー（; Molecular Devices社、サニーベール、カリフォルニア州1 - HL - U）でステージ上に搭載されています。
4.3接地電極
パッチピペットを作るために使用されるホウケイ酸ガラス管は、参照電極を作るために使用されています。 15センチメートル長い管は3個に切断されています。ガラスは可鍛性になるとチューブが90度の角度で"L"または"ホッケースティック"の形に曲げることができるまで2先の細いピンセットで、真空管は、ブンゼンバーナーの炎で開催されています。ガラス管がまだ熱いですが、一方の端はすぐにホット3M CsCl及び毛管作用によってチューブに描かれている1.5％アガロース溶液に浸漬される。参照電極が完全に溶液を充填されると、それは冷たい水のビーカーに入れられます。参照電極のすべてがいっぱいになった後で、それらは個別に外部から余分なアガロースを削除するにはキムワイプで拭いていると3M塩化セシウム溶液中に浸漬されています。 3M塩化セシウムの溶液で満たされた電気生理学的記録については、参照電極は、微小電極ホルダーハーフセル（世界プレシジョンインスツルメンツ（株）、サラソタ、フロリダ;＃MEH3RF15ホルダー90 Fペレット1.5mm）の内に保持されています。 （浴溶液の接地電極の図は、図7を参照）
4.4電気生理学的記録のソリューション
電位依存性イオンチャネルの種類が異なると、イオンの透過性/選択性に応じてさまざまなレコーディングソリューションが必要です。電位依存性カルシウムチャネルの場合、セルは通常、種々の濃度のバリウムまたはカルシウムのいずれかを含む外部のソリューションを浴びています。例えば、無脊椎動物Cav3電位依存性カルシウムチャネル（LCav3）の電気生理学的記録は、TEA - OHで7.4に調整したpHを5mMのCaCl 2を 、166mMテトラエチルアンモニウム（TEA - Cl）を、10mMのHEPESを含む外部のソリューションを使用して実行することができます。パッチピペットは125mmの塩化セシウム、10mMのEGTA、2mMのCaCl 2を 、1mMのMgCl 2を 、4mmのMgATP、0.3mmのトリス- GTP、および7.2（Senatoreとスパッフォード、2010）のpHの10mMのHEPESの内部溶液で満たされている。脊椎動物L -型電位依存性カルシウムチャネル（LCav1）は電荷担体（15mmのBaCl2、1mMのMgCl 2を 、10mmのHEPES、40mmのTEA - Clを、72.5mM塩化セシウム、10mMのグルコース、と同様にバリウムを含む外部のソリューションを使用して記録することができます。 TEA - OH）と108mMのCs -メタン、4MMのMgCl 2、9mmのEGTA、9mmのHEPESを含む内部溶液を7.2に調整したpHは、pHはCsOH（Senatore らを7.2に調整。、2010）。
4.5全細胞記録
- トランスフェクトした細胞を（異種イオンチャネルやイオンチャネル複合体を発現する）を含むカバースリップは、外部録音ソリューションの〜3MLを含む35ミリメートルのプラスチックペトリ皿に移している。薬の既知量をマイクロピペットでシャーレに追加される薬の実験を行う際に、記録液の体積を正確に測定する必要があります。研究者が実験に応じて、この温度を変更することが電気生理学的記録は、通常、室温で行われている。
- 細胞は、落射蛍光顕微鏡で可視化し、隔離された、積極的にトランスフェクション、付着緑の細胞は、視野の中央にセンタリングされます。
- パッチピペットは、パッチピペットの電極と参照電極との間の回路を完了マイクロマニピュレーターを用いて浴溶液、に低下する。バスモードのときに、pClamp10.1ソフトウェアは、ピペットと参照電極との間の小繰り返し電圧ステップを生成するためにアンプを引き起こし、方形波のトレース（図8A）とその結果生じる電流を表示します。この方形波のトレースは、パッチを適用するセルの前にアンプのオフセットピペットを使用してゼロにしなくてはならない。ピペットの抵抗はpClamp10.1ソフトウェアによって測定され、そして2 - 5MΩ内にある必要があります。
- バスモードのときに、ピペットが方形波のトレースの急激な変動として可視化できる細胞、の近接に持ち込まれ、その後吸引の小さな量はピペットとの間にgigaohmシールを形成するためのパッチピペットに適用されます。膜（方形波のトレースの完全なフラットラインを引き起こす、図8B）。
- プログラムは、パッチモードに切り替えられ、そしてピペットの容量は、（フラット現在のトレースの先頭と末尾のエッジ上の現在の小さいブリップとして目に見える、図8B）アンプのピペット容量の補償で補償されます。
- 吸引の小さいながらもシャープな量が破裂するパッチ内膜を適用し、細胞の内側への電極のアクセスを許可されています。成功した膜の破裂は、現在の波形のトレース（図8C）の先頭と末尾のエッジ上の大容量過渡の外観によって示されます。いったん達成された突破、プログラムセルモードと全セル容量の補償に切り替えられるが、容量のトランジェントを除去するために、アンプに調整されます。録音に先立って細胞内に細胞内記録液の平衡を可能にするために数分間の遅延があります。
- 電圧指令が生成され、データがpClamp10.1ソフトウェアと組み合わせてDigidata 1440Aアナログ - デジタルコンバータのインターフェースを装備したコンピュータを使用して取得されます。ユニークな電圧クランププロトコルは、各実験のために書かれており、これらはトランスフェクトした細胞からのイオンチャネル電流を記録するために使用されます。図9は、無脊椎動物LCav3電位依存性カルシウムチャネルを発現しているHEK - 293T細胞から記録されたカルシウム電流を示しています。セルは、+20 mVの- 70mVの間、および増分depolarisations - 110mVの電圧で開催された内向きカルシウム電流を引き出すために取られた。
- 記録された電流は、ローパスベッセルフィルタを使用して、10 kHzで、ろ過し、2 kHzのサンプリング周波数でデジタル化されています。最小限のリーク（<10％）を持つ唯一の録音は、分析に使用され、そしてオフラインリーク減算がClampfit 10.1ソフトウェアを用いて行われる。
記録された細胞のうち4.6薬物の研究
薬は直接記録されて皿に分注したことがあります。薬の量が追加された場合の薬の濃度を計算することができ、浴溶液の量が知られている。薬剤の高価または限定された量は、テフロン弁を通して作動either 8つのチャンネルSmartsquirt圧マイクロ灌流システム（自動化サイエンティフィック）や重力流システムを使用して、250ミクロンremovable先端が灌流鉛筆ポリイミドマルチバレルマニホールドからmicroperfusionによって追加される可能性がありますとValvelink8バルブコントローラ（科学自動化、灌流システムのセットアップについては、図5を参照）。 microperfusionシステムからの流量は、灌流の鉛筆記録されたセルから400ミクロンを出るストリームで毎分0.1mlをに設定されています。記録電極の先端からの血流鉛筆の先端の距離は、パッチからパッチに一貫している必要があります。図10は、40倍の倍率で表示されて提案された距離を示しています。十分な流量が記録された細胞の飽和灌流を提供しています。薬の実験がmicroperfusionを使用して行われる前に、細胞は連続的なストリームの制御浴溶液のmicroperfusionと平衡状態にある。ストリームの中断を最小限に抑え、制御バス、薬剤や洗浄液からの迅速な切り替えにより、実験中に回避されます。記録皿の端に取り付けられた吸引はtを使用することができます。Oは、注射器または蠕動ポンプ駆動装置（例えばMINISTARミニチュアDC蠕動ポンプ、世界の精密機器）の使用について、マニュアル吸引によって、ソリューションのオーバーフローを削除します。非常に急速な血流が現在のカルシウム（鵬ら、2005）を変更することがせん断力を誘発するので注意を払う必要があります、記録されているセルを洗い流す、と早すぎると薬剤リザーバを激減することがあります。
直接皿対灌流システムにペッティング
| 直接ピペッティング | マイクロ灌流システム | 重力流の灌流システム | |
| 必要なボリュームの薬剤 | 中等度の | 低 | 高 |
| テクニカルスキル | 低 | 中 | 中 |
| 機器コスト | 低 | な | な |
| セットアップとクリーンアップの日々の時間 | なし | 20 +分 | 20 +分 |
| 装置の汚染 | なし | はい | はい |
| トラブルシューティング | 簡単 | 複雑 | 複雑 |
| 皿の保証薬 | はい | なし | なし |
| 薬物添加して細胞を失う | はい | はい | はい |
| 薬のコンクを大幅に削減。洗浄することにより | 困難 | 簡単な | 簡単な |
| 複数の用量応答曲線を行うことの容易さ | 最適では | 簡単な | 簡単な |
| 結果の再現性 | OK - pippetingの位置に依存 | 良好な | 良好な |
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Discussion
記載されているプロトコルとソリューションを使用して、細胞全体の電流を記録するためにできることは、トランスフェクションが成功したことを、所望の電圧依存性イオンチャネルやイオンチャネル複合体は細胞膜でかなりの量で存在していることを示しています。細胞は積極的にトランスフェクト（すなわち蛍光緑）が記録可能な電流、28で追加のタイム° Cが適切にパッケージ化し、細胞膜に挿入されるチャネルタンパク質を可能にするために必要となる場合がありますが持っていない必要があります。 28でその長時間のインキュベーションを注意してください°パッチクランプ記録は、より困難なこと、Cは細胞がカバーガラスからデタッチされます、そして膜が死んだ細胞からごみを不安定化して蓄積する。このプロトコルで提案されている時間のすべては、私たちの特定のチャンネル用に最適化されています。他のチャネルとそのサブユニットは、より長いまたはより短いインキュベーション時間を必要とするかもしれません、そして、必要に応じて我々のプロトコルは、さらに調整することができます。特定のチャネルのために貧しい人々のトランスフェクション効率は、（すなわち少ない蛍光細胞と細胞当たりの低蛍光強度）を効率的にトランスフェクト、高い蛍光細胞よりも良い結果になります。 、トランスフェクション試薬の不適切なミキシング、次善の録画ソリューション、およびチャネルまたはチャネルの変異/組換えが不適切に生成するcDNA構築物をサブユニットアクセサリータンパク質の欠如（S）：細胞が蛍光であることが記録可能な電流を持っていない、考慮すべき点をトラブルシューティングすべき折り畳まれたまたは非発現チャンネル。
図1：ヒト胚性腎臓293T細胞（HEK - 293T）が 90％に通気孔25平方センチメートルフラスコ中のCO2インキュベーター（5％CO2）で37℃で接着単層でコンフルエントと1時12分、1:8と1:4で分割栽培されている希釈。細胞は通常、〜90％コンフルエントから、隔週で分割されます。類似の〜90％の分割でコンフルエントを確保するために、細胞は月曜日に1:8希釈で分割され、木曜日午前1時12分されています。トランスフェクションの前に、完全にコンフルエントフラスコは、新しいフラスコに1:4に分割され、そして細胞が3-4時間のためにCO2インキュベーター内で37℃で添付を許可されます。
図2：HEK - 293Tのイオンチャネルの異種発現のための戦略 （左）イオンチャネルcDNAをプラスミドpIRES2 - EGFPのマルチクローニングサイトにクローニングされています。およびEGFPをコードする配列（緑色）、内部リボソーム侵入部位のすぐ上流の配列（赤）をコードするイオンチャネル（青IRES）を含むmRNA分子の製造におけるHEK細胞の結果にこれらの構造の（右）トランスフェクション。 EGFPを翻訳し、細胞質内に保持されている間のイオンチャネルは、翻訳され、ERを介した細胞膜と細胞内膜系に運ばれます。
図3：HEK - 293T細胞、および電気生理学的記録のためのカバースリップ上の細胞のメッキ （）（ トップパネル）で28℃でインキュベートしたHEK - 293T細胞、四日間、トランスフェクション後の異種イオンチャネルのcDNAのトランスフェクションと発現 pIRES2 - EGFP哺乳類CMV発現ベクター中に抱いてLCav3カルシウムチャネル。 （ボトムパネル）上記細胞はトリプシン処理し、ガラス製カバースリップ上にプレーティングし、電気生理学的記録のために単離した。微分干渉コントラスト顕微鏡（DIC）。
図4：典型的な電気生理学的記録のリグのセットアップは、電気生理学的記録のリグのコンポーネントは、アンプ（）、パーソナルコンピュータ（PC）、Digidata 1440Aアナログ-デジタル変換器インターフェース（C）、モーター、デュアルピペットマニピュレータ（PM）が、含まれています落射蛍光顕微鏡（M）、潅流システム（P）、TMC 63から500シリーズの防振テーブル（VT）、40背の高いタイプIIファラデーケージ（FC）、およびフリースタンディング19金属、電気ラック（R）。
図5：。灌流システムは、（A）重力流システムは、テフロンのバルブとValvelink8コントローラを使用して操作。 （B）8チャンネルのSmartsquirt圧マイクロ灌流システム。どちら灌流システムのマルチバレルマニホールドのヒントは電動マニピュレータに搭載されている。
図6：。10倍（左）と40倍（右）の倍率で示すように磨かれた、パッチピペットパッチピペットは、フィラメントとピペットチップの表面を滑らかに磨かれた火災によるホウケイ酸ガラス毛細管から生成されました。ピペットプラーのプログラムは、当社の電気生理学のセットアップでは2 -5MΩの読書を与えたピペットを生成するよう最適化されました。
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図7：記録の皿のグランド電極とパッチピペットパッチピペット（右）と接地電極（左、白矢印）、記録液中で。
図8：パッチを作る工程を示すpClamp10.1スクリーンショットバスモードで観測された（）矩形波のトレース。。 （B）パッチモードでGigaohmシールは、平坦な現在のトレースの先頭と末尾のエッジ上の現在の小さいブリップとして目に見えるピペットの容量を持つ方形波のトレースの平坦化につながる。 （C）セルモードにおけるブレークスルーとしばらくして、大容量のトランジェントが見られます。
図9：電気生理学的結果 （左）記録内側電位依存性カルシウム電流は、異種イオンチャネル（例えばLCav3）の成功したトランスフェクションと発現を示している。 （右）トランスフェクトされていない細胞は、記録可能な電流はありません。細胞は、ソフトウェアが- 110mVで細胞を保持し、背部の下の保持電位- 110mVにし250msecのための- 70mVのためにステップするように指定IVプロトコルを行った。各時間ステップでは、最後のステップは、+20 mVになるまでの手順では、- 60mVを等- 70mVのためになるように10mVの増加。結果はL. stagnalisから脊椎動物のT -型（Cav3）電位依存性カルシウムチャネルのホモログのためLCav3と呼ばれている。
図10：記録の溶液中で電極とmicroperfusionの鉛筆のアレンジメント （）パッチピペットは、ホウケイ酸ガラス（右）から作らおよび薬剤の血流（左）のためのマルチバレルマニホールドチップをポリイミド。ホッケースティックの微小電極ホルダーハーフセルで開催されたとして3M CsCl及び1.5％アガロース溶液で満たされたホウケイ酸ガラスの接地電極は、（戻って）曲がって。灌流の鉛筆の先端と記録の微小電極の顕微鏡で（B）40倍ビュー。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、グラント、カナダの自然科学と工学研究評議会（NSERC）、NSERCアレクサンダーグラハムベルカナダ大学院奨学金（博士課程）（A. Senatoreまで）と心臓脳卒中財団からJDSに検出動作グラントによってサポートされていました＃6284 NA -補助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech Laboratories | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 - 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Micr–lectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments, Inc. | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige International | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).
- Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
