Summary
Metodo affidabile per l'alta efficienza
Abstract
L'espressione in vitro e la registrazione elettrofisiologica di ricombinante voltaggio-dipendenti canali ionici in colture di cellule renali umane embrionali (HEK-293T) è una strategia di ricerca onnipresente. HEK-293T cellule devono essere placcato sulla coverslips vetro a bassa densità sufficiente in modo che non siano in contatto tra loro al fine di consentire la registrazione elettrofisiologica senza effetti confondenti dovuti al contatto con le cellule adiacenti. Canali transfettate deve anche esprimere ad alta efficienza a livello della membrana plasmatica per la cellula intera registrazione patch clamp delle correnti rilevabili di sopra dei livelli di rumore. Canali ionici eterologa spesso richiedono lunghi periodi di incubazione a 28 ° C dopo trasfezione al fine di raggiungere un'adeguata espressione di membrana, ma ci sono sempre perdite di cellule coprioggetto adesione e la stabilità della membrana a questa temperatura. Per aggirare questo problema, abbiamo sviluppato una strategia ottimizzata per trasfezione e piastra HEK-293T cellule. Questo metodo richiede che le cellule sono transfettate in una confluenza relativamente alto, e incubate a 28 ° C per diversi periodi di incubazione post-trasfezione per consentire un'adeguata espressione della proteina del canale ionico. Cellule transfettate vengono placcati su coprioggetto di vetro e incubate a 37 ° C per diverse ore, che permette di attaccamento cellula rigida per i coprioggetti e ristabilizzazione della membrana. Le celle possono essere registrate subito dopo placcatura, o possono essere trasferiti a 28 ° C per l'incubazione ulteriormente. Troviamo che l'incubazione iniziale a 28 ° C, dopo trasfezione ma prima di placcatura, è la chiave per l'espressione efficace dei canali ionici eterologa che normalmente non esprimono bene a livello della membrana plasmatica. Positivamente transfettate, cellule in coltura sono identificati da co-espressi eGFP o eGFP espresso da un vettore bicistronic (ad esempio pIRES2-EGFP) contenente il canale ionico del DNA ricombinante appena a monte di un sito interno ingresso ribosoma e una sequenza eGFP codifica. Whole-cell patch clamp registrazione richiede attrezzature specializzate, oltre alla lavorazione di elettrodi di registrazione e lucido a forma di L elettrodi di massa in vetro borosilicato. Somministrazione di farmaci per studiare la farmacologia dei canali ionici può essere ottenuto direttamente micropipetting droga nel piatto di registrazione, oppure utilizzando microperfusione o sistemi di flusso di gravità che producono flussi ininterrotti di soluzione farmaco sulle cellule registrate.
Protocol
1. Colture Cellulari
- Embrionali umane del rene 293T cellule (HEK-293T, Invitrogen) sono cresciute in monostrati aderente in ventilati 25 centimetri 2 palloni (coltura dei tessuti trattati; Cellstar; Greiner Bio-One), contenente 6 ml di Dulbecco modificato (DMEM; Sigma Aldrich), integrate con 10 % v / v siero fetale bovino (FBS; Sigma Aldrich), piruvato di sodio 1%, e 250 mg / ml penicillina / streptomicina a 37 ° C con 5% di CO 2).
Le cellule sono incubate in CO 2 incubatori (5% CO 2) impostato a 37 ° C o 28 ° C. Tutti i lavori con le cellule è fatto in una cappa a flusso laminare. - Le cellule sono generalmente divisi bi-settimanali, da ~ 90% di confluenza, in una diluizione 1:08 di lunedì e il giovedì 01:12. (Vedi Figura 1 per immagini di cellule HEK-293T placcato a diversa densità)
- Per la divisione, i media viene rimosso dal fiaschi di cellule per aspirazione, e le cellule si staccano applicando 1 ml di tripsina (Sigma Aldrich) soluzione riscaldata a 37 ° C al pallone invertita. Il pallone viene poi invertito e dolcemente cullato a mano in modo tale che la soluzione tripsina si muove sopra le cellule attaccato più volte. La tripsina è poi rapidamente rimosso per aspirazione e 250 ml di tripsina è micropipetted nel pallone, che è ancora una volta scosso per spostare la soluzione tripsina sulle celle.
- Palloni vengono poi incubate in un incubatore CO 2 set a 37 ° C per 3-5 minuti, e una pipetta viene usato per sospendere le cellule in 4 ml di DMEM caldo integrato. Tripsinizzazione incompleta e sospensione causerà grumi di cellule e potrebbe indurre le cellule a crescere verso l'alto e non in monostrato previsto. Over-tripsinizzazione possono danneggiare le cellule.
- Per una frazione di 1:8, aggiungere 500μL di cellule sospese vengono aggiunti a un pallone nuovo contenente 5.5ml di DMEM, per una frazione di 1:12 (vedi Figura 1), 333μL di cellule vengono aggiunti a un pallone nuovo contenente 5.7mL di DMEM . Fiaschi sono delicatamente miscelati poi trasferito in un incubatore a 37 ° C. Durante la 3-4h di incubazione a 37 ° C dopo la divisione, le cellule si sedimenta e aderire al pallone. Le cellule inizialmente guardo intorno ma appiattire e hanno estensioni (pseudopodi) con più salda allegato (Figura 1).
Le cellule devono crescere in un monostrato aderente in modo prevedibile. Dovrebbe crescita cellulare e l'aspetto è atipico o incoerenti, scarsa tecnica o contaminazione (batteri / micoplasma) deve essere considerato. La chiave per la cultura dei tessuti di successo è la coerenza.
2. Trasfezione di HEK-293T con cDNA ricombinante canali ionici
- Qui, cDNA da vari canali ionici vengono clonati in pIRES2-EGFP plasmide (BD Biosciences Clontech), che consente l'identificazione di cellule transfettate positivamente attraverso un'accresciuta proteina fluorescente verde (eGFP) fluorescenza. Il eGFP è prodotta nelle cellule transfettate dalla trascrizione stessa l'inserto clonato cDNA, attraverso la traduzione iniziata in un sito interno ingresso ribosoma solo a valle del cDNA e inserire a monte della sequenza codificante eGFP (Figura 2). Vedi Figura 3 per le immagini di fluorescenza HEK-293T, positivamente transfettate con subunità dei canali del calcio in pIRES2-EGFP costrutti.
- Prima di transfezione, un pallone pieno confluenti è diviso 01:04 in un pallone nuovo, e le cellule sono autorizzati a fissare a 37 ° C in un incubatore di CO 2 ore 3-4 (vedi Figura 1).
- Dopo che le cellule sono collegati, uno standard di fosfato di calcio strategia di trasfezione (Cold Spring Harbor protocolli) è usato per introdurre costrutti contenenti dei canali ionici e cDNA subunità accessorie nelle cellule HEK. Tipicamente, un totale di 12μg di DNA in 600 ml di soluzione ise trasfezione utilizzato per bombola / trasfezione.
- Dopo che la soluzione di trasfezione è pipettati sulle celle goccia a goccia, il pallone viene inserito in un incubatore a 37 ° C durante la notte.
- A seguito di trasfezione, le cellule vengono accuratamente lavati tre volte con i media caldo o tampone fosfato (ml 4-5) pipettando la soluzione di lavaggio in una beuta capovolta, poi lentamente girando il pallone in posizione verticale e dondolo il pallone in modo che la soluzione di lavaggio si muove sopra il cellule. Se questo non viene fatto con attenzione le cellule potrebbero detatch e pochi saranno sinistra dopo le tre fasi di lavaggio. Il lavaggio viene ripetuto altre due volte, poi 6 ml di media sono aggiunti al pallone ed è incubata a 37 ° C per 2 ore, poi trasferito in un 28 ° C incubatore.
- Trasfezione di successo di pIRES2-EGFP costrutti possono essere confermate 1 a 3 giorni dopo la transfezione utilizzando un microscopio a epifluorescenza. Le cellule che fluorescenza verde se esposto ai raggi UV sono positivamente transfettate e deve esprimere il canale ionico e proteine eterologhe eGFP.
3. Placcatura transfettate cellule HEK293T in preparazione per la registrazione elettrofisiologica
nt "> ioni di diversi canali di esprimere con diverse efficienze a livello della membrana cellulare delle cellule HEK, e come tale, il resto di questo protocollo richiede una certa ottimizzazione per massimizzare la superficie espressione canali che consente per la riuscita registrazione elettrofisiologica. espressione di canali ionici eterologhe in cellule HEK, soprattutto di quelli provenienti da fonti non-mammiferi, può presentare alcune difficoltà tra cui (1) Le dimensioni delle proteine di grandi dimensioni che richiedono tempi lunghi per tradurre e localizzare sulla membrana plasmatica (2) assenza o difformità di piegatura e targeting motivi sulla proteina canale necessari in un mammifero linea cellulare (3) le differenze nelle frequenze di utilizzo codone da specie a specie. Tutti questi fattori combinati possono provocare un requisito per i tempi lunghi di incubazione a 28 ° C, che assicura un'efficace espressione e la localizzazione delle proteine di superficie, senza la divisione cellulare (che dovrebbe diluire fuori il cDNA eterologo e proteine). Purtroppo, per lunghi periodi di incubazione a 28 ° C porta al distacco delle cellule e la stabilità della membrana poveri rendendo registrazione elettrofisiologica difficile. Abbiamo deciso di modificare le strategie di trasfezione convenzionali (recensione a Thomas e Smart 2005) al fine di minimizzare l'incubazione a 28 ° C prima della registrazione e per massimizzare l'espressione di superficie. Il nostro metodo richiede che le cellule sono transfettate, incubate per un periodo di 3-7 giorni a 28 ° C, quindi le cellule sono staccati da tripsinizzazione e saltuariamente su coprioggetto e incubate a 37 ° C che restabilizes membrane e permette di forte attaccamento di cellule sul vetrino coprioggetto. cellule sono poi in grado di essere registrate subito, o può essere incubate per ulteriori periodi di tempo a 28 ° C. Troviamo la replating di cellule su coprioggetto in questa fase successiva nel nostro metodo che sia assolutamente essenziale per la produzione di coprioggetto con un gran numero di canali che esprimono, separare le cellule in allegato.Vi presentiamo due strategie alternative, quella che noi preferiamo usare per i canali ionici e complessi dei canali ionici che non contengono grandi domini extracellulari che potrebbero essere vulnerabili alla digestione tripsina (ad esempio CAV3 voltaggio-dipendenti canali del calcio, Senatore e Spafford 2010), e uno che usiamo per i canali ionici, che contengono grandi domini extracellulari (ad esempio L-type voltage-gated canali del calcio e le loro subunità accessorie;. Senatore, et al 2010).
- Le cellule sono incubate a 28 ° C per 2-6 giorni per evitare la divisione cellulare e per consentire l'accumulo di proteine tradotte. Questo tempo di incubazione deve essere determinato empiricamente per ogni canale ionico, in quanto espressione di superficie dipende da fattori intrinseci che determinano il modo mRNA nascente dei canali 'e le sequenze polipeptide interagire con le macchine traslazionale e la via secretoria, rispettivamente.
- Prima di placcatura, coprioggetto di vetro circolare (Circles N. 1 - da 0,13 a 0,17 millimetri di spessore; Dimensioni: 12 mm, Fisher Scientific Canada, Ottawa, Ontario) sono rivestiti con poli-L-lisina (Sigma), come le istruzioni del produttore per il.
- Media è rimosso per aspirazione da cellule transfettate, e 1 ml di 37 ° C tripsina soluzione (Sigma) è micropipetted in un fiasco invertita (lato della cella verso l'alto). Il pallone viene poi capovolta con cautela per la posizione verticale per permettere la tripsina a correre sulle celle, e il pallone viene poi nuovamente invertita e la tripsina rimosso per aspirazione. 250 microlitri di tripsina caldo è poi aggiunto direttamente sulle celle e il pallone viene incubata a 37 ° C per 3-5 minuti fino a quando il detatch cellule.
- Nel frattempo, poli-L-lisina rivestite coprioggetto sono inseriti in capsule di Petri 6 millimetri (3-8 per ogni piatto) e 5 ml di terreni di coltura caldo viene aggiunto a ogni piatto.
- Trypsinized cellule sono risospese con 4 ml di terreni di coltura caldo pipettando su e giù ~ 6 volte, quindi 250-500μL di cellule risospese sono micropipetted nei piatti di coltura contenente lamelle. Prima dell'aggiunta di cellule, la punta della micropipetta viene usato per spingere il coprioggetto per garantire che essi siano alla base del piatto.
- Le cellule vengono poi incubate a 37 ° C per 3 ore per permettere loro di aderire al coprioggetto, e poi si sono trasferiti a 28 ° C. A questo punto, le cellule sono pronte per la registrazione elettrofisiologica, ottimamente fatto con separato-attached cellule (Fig.3 illustra cellule transfettate prima e dopo piastrato su coprioggetto). Lasciando le cellule per troppo tempo a 37 ° C si tradurrà nella divisione cellulare.
- Preparazione di cellule che esprimono canali / complessi canale con grandi domini extracellulare è svolta in modo molto simile come sopra indicato, con l'eccezione che coprioggetto vengono incubate a 28 ° C per altri 2-4 giorni prima della registrazione elettrofisiologica viene effettuata. Ciò consente una riaccumulazione di canali / canale complexes a livello della membrana cellulare dopo tripsinizzazione.
4. Registrazione elettrofisiologica dei canali ricombinanti in cellule HEK-293T
Diverse le risorse complete sono disponibili che descrivono i concetti generali alla base registrazione elettrofisiologica (ad esempio Ogden e Stanfield 1987; Molleman 2003).
4,1 Elettrofisiologia rig
Un tipico impianto di elettrofisiologia (Figura 4) comprende un amplificatore (ad esempio Axopatch 200B o Multiclamp amplificatore 700B, Axon Instruments, Union City, CA), un PC dotato di un 1440A Digidata analogico-digitale convertitore di interfaccia in congiunzione con pClamp10.1 software (Molecular Devices, Sunnyvale, California), motorizzato, manipolatori pipetta doppia (MPC-385-2, Instrument Company Sutter), un microscopio a epifluorescenza (Axiovert 40 CFL, Zeiss Canada, Toronto, Ontario) e sistemi di perfusione (figure 4 e 5 ). Le vibrazioni sono limitate montando l'attrezzatura su un tavolo 63-500 isolamento TMC vibrazioni serie (Technical Manufacturing Corporation, Peabody. MA). Stray rumore elettrico è limitato con un 40 "alto di tipo II gabbia di Faraday (TMC) che circondano l'impianto elettrico montato sul tavolo isolamento dalle vibrazioni. Sistemi di controllo elettronico (come i computer e monitor, amplificatore, analogico-digitale convertitore, manipolatore motorizzato e sistema di perfusione ValveLink di controllo) sono montati al di fuori della gabbia di Faraday ad un free-standing cremagliera elettrico metallico (Hammond Manufacturing, Guelph Ontario). Tutte le apparecchiature elettriche è messo a terra a un distributore di rame e collegati a un trasformatore di isolamento Medical Grade (1800W, Tripp Lite UL60601-1) che fornisce l'isolamento di linea, un terreno consistente e soppressione delle sovratensioni.
4,2 Patch pipette
Tubi di vetro borosilicato capillare con filamento (OD 1,5 mm, diametro 0,86 millimetri, 15 centimetri di lunghezza; BF150-86-15; Instrument Company Sutter) vengono tagliati a metà e inserito in un Flaming / Brown Micropipetta Estrattore modello P-97 (Instrument Company Sutter) . Una pipetta-estrattore programma è ottimizzato per generare costantemente pipette con resistenze da 2 a 5MΩ da elettrodo a terra (dopo la lucidatura fuoco; Fig.6) Pipettes sono individualmente fuoco lucido per levigare le superfici puntale che permette di tenuta stretta contro le membrane cellulari ( micro Forge MF-830; Narishige, Giappone, figura 6). Micropipette sono montati sul headstage con un supporto specializzato (1-HL-U; Molecular Devices, Sunnyvale California).
4,3 a terra elettrodi
I tubi in vetro borosilicato usato per fare pipette patch sono utilizzati anche per fare elettrodi di riferimento. I tubi di 15 cm vengono tagliati in 3 pezzi. Con 2 pinze a punta fine, i tubi sono tenuti in una fiamma becco Bunsen fino a quando il vetro diventa malleabile e il tubo può essere piegato a "L" o "bastone da hockey" forma con un angolo di 90 °. Mentre i tubi di vetro sono ancora caldi, una delle estremità è subito immerso in un caldo 3M CsCl e 1,5% di soluzione di agarosio cui è redatto nel tubo per azione capillare. Una volta che un elettrodo di riferimento è completamente pieno di soluzione, è collocato in un bicchiere di acqua fredda. Dopo tutti gli elettrodi di riferimento sono pieni, sono singolarmente pulito con Kimwipes per rimuovere supplementare agarosio dall'esterno e sono immersi in una soluzione 3M CsCl. Per la registrazione elettrofisiologica, gli elettrodi di riferimento sono tenuti in una Holder microelettrodo Half-Cells (Holder 90 F pellet 1.5mm; # MEH3RF15; Mondiale Precision Instruments Inc., Sarasota in Florida) riempita con una soluzione 3M CsCl. (Vedi Figura 7 per l'illustrazione di un elettrodo di massa in soluzione bagno)
4,4 Elettrofisiologia registrazione soluzioni
Diversi tipi di voltaggio-dipendenti canali ionici richiedono soluzioni di registrazione differenti a seconda della permeabilità agli ioni / selettività. Per voltaggio-dipendenti canali del calcio, le cellule sono in genere immersi in soluzioni esterne contenenti bario o calcio a diverse concentrazioni. Per esempio, la registrazione elettrofisiologica del invertebrati CAV3 voltaggio-dipendenti del canale del calcio (LCav3) può essere effettuata utilizzando una soluzione esterna contenente 5mM CaCl 2, 166mm tetraetilammonio (TEA-Cl), HEPES 10 mM con un pH regolato a 7,4 con TEA-OH. Pipette di patch sono riempiti con una soluzione interna di 125 mm CsCl, 10mM EGTA, 2mM CaCl 2, 1 mm di MgCl 2, MgATP 4 mm, 0,3 mm Tris-GTP, e HEPES 10mm con un pH di 7,2 (Senatore e Spafford, 2010). Il invertebrati tipo L voltaggio-dipendenti del canale del calcio (LCav1) possono essere registrati con una soluzione esterna che contiene bario come portatori di carica (15mm BaCl2, 1MM MgCl 2, HEPES 10mm, 40mm TEA-Cl, 72.5mM CsCl, glucosio 10mM, con il pH regolato a 7,2 con TEA-OH) ed una soluzione interna contenente 108mm Cs-metanosolfonato, 4mm MgCl 2, 9mm EGTA, HEPES 9mm, pH regolato a 7,2 con CsOH (Senatore et al., 2010).
4,5 di registrazione cellula intera
- Un coprioggetto contenente cellule transfettate (che esprime canali ionici eterologo o complessi di canale ionico) viene trasferito ad un piatto 35 millimetri di plastica petri contenenti 3 ml di soluzione ~ registrazione esterno. Il volume di soluzione di registrazione deve essere misurata con precisione quando si eseguono esperimenti con la droga, dove quantità note di farmaco sono da aggiungere al piatto con una micropipetta. Le registrazioni elettrofisiologiche sono in genere fatto a temperatura ambiente, anche se il ricercatore può desiderare di modificare tale temperatura in funzione l'esperimento.
- Le cellule vengono visualizzati attraverso un microscopio a epifluorescenza e un isolato, positivamente transfettate, aderente cellula verde è centrata nel mezzo del campo di vista.
- La pipetta patch è calato nella soluzione del bagno con un micromanipolatore, che completa il circuito tra l'elettrodo nella pipetta di patch e l'elettrodo di riferimento. In modalità bagno, la pClamp10.1 software provoca l'amplificatore di generare piccoli passi tensione ripetendo tra la pipetta e l'elettrodo di riferimento, e visualizza la corrente risultante come traccia onda quadra (Figura 8A). Questa traccia onda quadra deve essere azzerato con la pipetta di offset dell'amplificatore prima di patching una cella. La resistenza pipetta è misurata dal software pClamp10.1, e dovrebbe essere all'interno di 2-5MΩ.
- In modalità bagno, la pipetta è portato in prossimità della cellula, che può essere visualizzato come rapide fluttuazioni nella traccia onda quadra, allora una piccola quantità di aspirazione viene applicata la pipetta di patch per formare un sigillo gigaohm tra la pipetta e la membrana (causa una completa linea piatta della traccia onda quadra; Figura 8B).
- Il programma è poi commutato in modalità patch e capacità pipetta (visibili come piccoli puntini di corrente sui bordi iniziali e finali della traccia piatta corrente; Figura 8B) è compensato con la compensazione capacità pipetta sull'amplificatore.
- Una piccola ma forte di aspirazione viene applicata la rottura della membrana nella patch e consentire l'accesso degli elettrodi all'interno della cellula. Rottura della membrana di successo è indicato dalla comparsa di grandi transitori capacitivi anche sul iniziali e finali bordi del tracciato attuale ondata (Figura 8C). Una volta sfondare è stato raggiunto, il programma passa alla modalità cellulare e tutta la capacità di compensazione delle cellule è regolata sull'amplificatore per rimuovere i transienti capacitivi. C'è un ritardo di qualche minuto per consentire equilibrio della soluzione di registrazione intracellulare nella cellula prima della registrazione.
- Comandi di tensione sono generate ei dati sono acquisiti utilizzando un computer dotato di un 1440A Digidata analogico-digitale convertitore di interfaccia in congiunzione con pClamp10.1 software. Unico protocolli morsetto di tensione sono state scritte per ogni esperimento, e questi vengono utilizzati per registrare le correnti dei canali ionici da cellule transfettate. Figura 9 illustra le correnti di calcio registrati da una HEK-293T cellula che esprime il invertebrati LCav3 voltaggio-dipendenti del canale del calcio. La cella è tenuto ad una tensione di-110mV, e depolarizzazione incrementale tra-70mV e +20 mV sono stati presi per suscitare correnti di calcio verso l'interno.
- Correnti registrate sono filtrati a 10 kHz con un passa-basso del filtro di Bessel e digitalizzati ad una frequenza di campionamento di 2 kHz. Registrazioni solo con perdite minime (<10%) sono utilizzati per l'analisi, e offline perdita sottrazione viene effettuata utilizzando il software Clampfit 10,1.
4,6 studi d'delle cellule registrate
I farmaci possono essere direttamente pipettati nel piatto in fase di registrazione. Concentrazione dei farmaci può essere calcolata se il volume del farmaco e volume di soluzione da bagno sono noti. Quantità limitate di costosi o farmaco può anche essere aggiunto microperfusione da un multi-barile molteplici poliimmide matita perfusione con una punta di 250 micron rimovibili, utilizzando un otto Smartsquirt canale micro pressione di perfusione (AutoMate scientifico) o sistema a flusso gravità gestiti tramite valvole in teflon e Valvelink8 controllori valvola (AutoMate scientifico; vedi Figura 5 per le impostazioni del sistema di perfusione). Portate da sistemi microperfusione sono fissati a 0,1 ml al minuto in un flusso di uscita dalla matita perfusione 400 micron dalla cella registrato. La distanza della punta perfusione matita dalla punta dell'elettrodo di registrazione dovrebbero essere uniformi di patch per patch, figura 10 illustra una distanza suggerito visibile con ingrandimento 40x. I tassi di flusso adeguato fornire perfusione saturando della cellula registrato. Prima che un esperimento di droga è condotta utilizzando microperfusione, le cellule sono in equilibrio con la microperfusione della soluzione di controllo bagno in un flusso continuo. Minima interruzione del flusso è evitata durante l'esperimento con un rapido passaggio dal bagno di controllo, di droga o la soluzione di lavaggio. Aspirazione montate sul bordo del piatto di registrazione possono essere usati trimuovere o troppo pieno di soluzioni, mediante aspirazione manuale con una siringa o utilizzando un dispositivo di azionamento pompa peristaltica (ad esempio MINISTAR miniatura DC pompa peristaltica, strumenti di precisione del Mondo). Bisogna fare attenzione perché la perfusione estremamente rapida induce forze di taglio che possono alterare l'attuale calcio (Peng et al. 2005), può lavare via la cellula in fase di registrazione, e impoverisce la riserva di droga troppo in fretta.
Direttamente nel piatto pipeting vs sistemi perfusione
| Pipettaggio diretto | Perfusione sistema micro | Gravità sistema a flusso perfusione | |
| Farmaco volume necessario | Moderato | Basso | Alto |
| Abilità tecnica | Basso | Medio | Medio |
| Apparecchiature di costo | Basso | Significativo | Significativo |
| Tempo giornaliero di setup e di pulizia | Nessuno | 20 + minuti | 20 + minuti |
| Contaminazione delle apparecchiature | Nessuno | Sì | Sì |
| Risoluzione dei problemi | Facile | Complesso | Complesso |
| Farmaco garantito piatto | Sì | No | No |
| Perdere cella con tossicodipendenza | Sì | Sì | Sì |
| Ridurre notevolmente conc droga. di lavaggio | Difficile | Lineare | Lineare |
| Facilità di fare un multiplo curva dose-risposta | Meno che ottimale | Lineare | Lineare |
| Riproducibilità dei risultati | OK - dipende dalla posizione del pippeting | Bene | Bene |
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Discussion
Essere in grado di registrare a cellula intera correnti utilizzando i protocolli descritti e soluzioni indica che la trasfezione ha avuto successo e che la tensione desiderata-canali ionici o complessi di canali ionici sono presenti con quantità significative a livello della membrana cellulare. Dovrebbe essere positivamente le cellule transfettate (cioè fluorescente verde) ma non sono le correnti registrabili, tempo supplementare a 28 ° C può essere necessario per consentire la proteina canale che deve essere adeguatamente imballati ed inserita nella membrana cellulare. Si noti che l'incubazione prolungata a 28 ° C induce le cellule a staccarsi dalla coprioggetto, e le membrane destabilizzare e si accumulano i detriti dalle cellule morte, rendendo la registrazione di patch clamp più impegnativo. Tutte le volte suggerito in questo protocollo sono stati ottimizzati per i nostri canali particolari. Altri canali e le loro subunità può richiedere tempi di incubazione più o meno lungo, e il nostro protocollo può essere ulteriormente regolato secondo necessità. Per alcuni canali di efficienza di trasfezione poveri (cioè meno cellule fluorescenti e abbassare l'intensità di fluorescenza per cella) produce risultati migliori rispetto transfettate in modo efficiente, cellule altamente fluorescente. Dovrebbero essere le cellule fluorescenti, ma non sono le correnti registrabili, i punti di risoluzione dei problemi da considerare sono: la mancanza di proteine accessorie (s); improprio miscelazione dei reagenti di trasfezione; sub-ottimali soluzioni di registrazione e mutazione / ricombinazione del canale o il canale subunità costrutti di cDNA produce impropriamente piegati o non esprimono canali.
Figura 1: Human cellule embrionali renali 293T (HEK-293T) sono cresciute in monostrati aderente a 37 ° C in incubatori a CO2 (5% CO2) ventilati fiaschi 25cm2 al 90% di confluenza e dividere a 1:12, 1:08 e 1:4 diluizioni. Le cellule sono generalmente divisi bi-settimanale, da una confluenza ~ 90%. Per garantire un simile ~ 90% di confluenza a divisione, le cellule sono suddivise in una diluizione 1:08 di lunedì e il giovedì 01:12. Prima di transfezione, un pallone pieno confluenti è diviso 01:04 in un pallone nuovo, e le celle sono permesso di allegare a 37 ° C in un incubatore a CO2 per 3-4 ore.
Figura 2: Strategia per l'espressione eterologa dei canali ionici in HEK-293T (Sinistra) cDNA canali ionici sono clonato nel sito di clonazione multiplo del plasmide pIRES2-EGFP.. (Diritto) Transfection di questi costrutti in cellule HEK risultati nella produzione di molecole di mRNA contenente il canale ionico codifica sequenza (rosso) a monte di un sito interno ingresso ribosoma (IRES, blu) e la sequenza codificante eGFP (verde). I canali ionici sono tradotti e trasportati alla membrana cellulare tramite il sistema di ER e endomembrane, mentre eGFP è tradotto e mantenuto nel citoplasma.
Figura 3:. Transfection ed espressione del cDNA eterologa canali ionici in cellule HEK-293T, e placcatura di cellule sul coprioggetto per la registrazione elettrofisiologica (A) (i pannelli superiore) HEK-293T cellule incubate a 28 C, quattro giorni dopo la transfezione con il LCav3 canali del calcio ospitato nella pIRES2-EGFP mammiferi vettore di espressione CMV. (Pannelli in basso) Le cellule sopra trypsinized e placcato su coprioggetto di vetro, isolato per la registrazione elettrofisiologiche. Contrasto interferenza differenziale microscopia (DIC).
Figura 4:. Una tipica configurazione elettrofisiologiche rig registrazione elettrofisiologiche componenti rig registrazione comprende un amplificatore (A), un personal computer (PC), Digidata 1440A analogico-digitale convertitore di interfaccia (C), motorizzato, manipolatori pipetta doppia (PM), un microscopio a epifluorescenza (M), sistemi di perfusione (P), TMC 63-500 vibrazioni isolamento serie tabella (VT), 40 di altezza di tipo II gabbia di Faraday (FC), e un free-standing 19 in metallo, cremagliera elettrica (R).
Figura 5: sistemi di perfusione (A) Un sistema di flusso per gravità operati con valvole in teflon e Valvelink8 controllori.. (B) Otto Smartsquirt canale pressione micro sistema di perfusione. Multi-Barrel Suggerimento collettore d'impianto sia perfusione è montato su un manipolatore motorizzato.
Figura 6:. Lucido, pipette patch mostrato a 10x (a sinistra) e 40x (a destra) ingrandimento Patch pipette sono stati generati da tubi in vetro borosilicato capillare con filamento e lucidate a fuoco per levigare le superfici puntale. Una pipetta-estrattore programma è stato ottimizzato per generare pipette che ha dato una lettura di 2-5MΩ elettrofisiologia nel nostro set-up.
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. Figura 7: elettrodo di massa e pipette di patch nel piatto registrazione Patch pipetta (a destra) e di terra di elettrodi (a sinistra, freccia bianca) in soluzione di registrazione.
Figura 8:. PClamp10.1 schermate che illustrano le fasi di fare una patch (A) traccia onda quadra osservato in modalità bagno. (B) Un sigillo Gigaohm in modalità di patch porta ad un appiattimento del tracciato un'onda quadra con capacità pipetta visibili come piccoli puntini di corrente sui bordi iniziali e finali della traccia piatta corrente. (C) Dopo la svolta e in modalità di cellule, grande transienti capacitivi sono visti.
Figura 9:. Elettrofisiologia risultati (a sinistra) verso l'interno registrabili voltaggio-dipendenti correnti di calcio indica trasfezione di successo e di espressione dei canali ionici eterologa (ad esempio LCav3). (Destra), le cellule Untransfected non hanno le correnti registrabili. Le cellule sono state sottoposte ad un protocollo IV, che specifica che il software tenere il cellulare a-110mV e poi passo a 70mV per 250msec poi di nuovo fino a-110mV tenendo potenziale. Ogni volta che il passo aumenta di 10mV in modo che i passaggi sono ecc-70mV, 60mV, fino a quando l'ultimo passaggio è a +20 mV. I risultati sono per un invertebrato di tipo T (CAV3) voltaggio-dipendenti omologo del canale del calcio di L. stagnalis definito LCav3.
Figura 10: Disposizione degli elettrodi e matita microperfusione nella soluzione di registrazione (A) pipette Patch realizzati in vetro borosilicato (a destra) e poliimmide multi-barile punta collettore per la perfusione di droga (a sinistra).. Elettrodo di massa (posteriore) in vetro borosilicato, pieno di 3M CsCl e 1,5% di soluzione di agarosio piegate come bastone da hockey terrà a Porta microelettrodo Half-Cells. (B) 40x vista attraverso un microscopio della punta della matita e perfusione microelettrodo registrazione.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di funzionamento Discovery per JDS dalle scienze naturali e ingegneria Research Council (NSERC) del Canada, un NSERC Alexander Graham Bell Canada Borse di studio Laurea (dottorato) (di A. Senatore) e la Heart and Stroke Foundation, Grant -In-Aid NA # 6284.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech Laboratories | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 - 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Micr–lectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments, Inc. | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige International | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).
- Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
