Summary
本文介绍的方法，以确定具体的配体的白细胞趋化反应和识别细胞表面的受体，并用活细胞成像技术的胞质蛋白质之间的相互作用。
Abstract
属于G蛋白偶联受体（GPCRs）的7个跨膜蛋白家族介导的细胞外信号传导到细胞内的反应。 GPCRs的控制多种生物学功能，如趋化，细胞内钙释放，基因调控配体依赖性通过异三聚体G蛋白的 1-2 。配体结合诱导了一系列构象变化，导致激活异三聚体G蛋白调节的第二信使，如环磷酸腺苷（cAMP）的，三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DG）的水平。激活受体配体结合伴随还发起了一系列活动，以衰减信号通过脱敏，封存和/或内部化的受体。 GPCRs的脱敏过程中发生通过受体磷酸化G蛋白受体激酶（GRKs）和β- arrestins 3随后结合。 β- arrestins是胞浆蛋白转运到细胞膜G蛋白偶联受体激活后，磷酸化的受体结合（大多数情况下）通过促 进受体的内化4-6存在。
白三烯B 4（LTB 4）是一种促炎性脂质分子，从花生四烯酸途径介导其行动派生通过GPCRs的，LTB 4受体1（BLT1;高亲和力受体）和LTB 4受体2（BLT2;低亲和力受体）7-9。 LTB 4 BLT1通路已被证明是在一些炎症性疾病，包括哮喘，关节炎，动脉粥样硬化10-17的关键。当前的纸张描述发展到显示器的LTB 4诱导白细胞迁移和BLT1的相互作用与β- arrestin的，在使用活细胞显微成像技术18-19中的受体易位的方法。
骨髓C57BL / 6小鼠的树突状细胞分离和培养作为先前描述 20-21 。这些细胞在活细胞成像方法进行了测试，证明LTB 4诱导细胞迁移。人类BLT1用红色荧光蛋白（BLT1 - RFP）的标签，在C -末端与绿色荧光蛋白（β- ARR - GFP）标记的β- arrestin1了两个质粒转染大鼠嗜碱性Leukomia（RBL - 2H3）细胞株18日至19日 。这些蛋白质和本地化之间的相互作用的动力学进行了监测使用的活细胞视频显微镜。在当前纸张的方法描述了利用显微技术研究G蛋白偶联受体在活细胞的功能反应。还介绍了当前的纸张MetaMorph软件的使用，以量化的荧光强度，以确定受体的动力学和胞浆蛋白的相互作用。
Protocol
方法
显微镜的说明
活细胞成像实验用的TE - FM系统连接到尼康的Eclipse TE300倒置显微镜落射荧光。显微镜配备加热阶段。一个凉爽的总部管理单元数字B / W CCD（罗伯科学）相机和LAMDA 10-2光学过滤器更换（萨特仪器公司）是连接到显微镜。激发和发射波长控制滤光轮和兰巴10-2滤光轮控制器控制仪器有限公司，萨特曝光时间为500 ms应该足够，以查看RFP或GFP在活细胞。 MetaMorph软件控制，硬件控制和图像采集。本研究过滤器的选择，过滤器设置S480/20x，S525/40m和S565/25x，GFP和RFP S620/60m，分别EGFP / DsRed的双分色，色度技术。该过滤器轮最多可容纳6个过滤器设置。显微镜连接之前Proscan阶段控制器操纵杆。 MetaMorph软件可以控制所有这些硬件附件。显微镜还附有Micromanipulators举行的微量。
A.测量白三烯B 4导演的树突状细胞迁移
使用上面介绍的显微镜设置，我们开发了实时配体定向的树突状细胞迁移的方法。 micromanipulators（Narishige）连接到显微镜。小鼠骨髓骨髓衍生的树突状细胞对的LTB 4梯度（BMDCs）的趋化作用被记录下来。在这里，我们描述的方法准备微移液器使用微量移液器拉马，装入微量移液器的配体和设立显微镜监测细胞的定向迁移的加热阶段的趋化实验。这种方法可应用于诱导迁移以及在活细胞趋化抑制剂的影响，以测试在不同的趋化因子的功效。已在若干出版物，包括朱庇特22 21 BMDCs从鼠标的隔离。
1。准备的BMDCs
- 板BMDCs盖玻片底部氟菜，让他们增长提前16小时的实验（培养后10天）。
- 3毫升的1X PBS至少2倍（加入3毫升的1X PBS板和吸缓冲区中）洗细胞。
- 加入2毫升的1XPBS板块。现在这些细胞为实验做好准备。细胞保持在37 ° C培养箱前实验。
微量加样器的配装的筹备工作：
- 修复的玻璃毛细管（玻璃标准，0.75毫米× 0.4毫米; 6“，猫＃625500，调幅系统，INC）在垂直的微量拉马（Narishige国际USA，INC）。
- 温度保持在52℃，使玻璃熔化和拉开，形成锋利的刀刃提示。
- 修正到微量移液器支架移液器。
- 微量加样器的使用伪造微粗糙的边缘平滑的M - 900（Narishige国际USA，INC）在显微镜下观看。
- 准备每个实验至少10-20移液器。注：微量，也可以从世界精密仪器（μ提示，T1801TW1F）购买。
- 考虑到1毫升effendorf管所需的配体浓度（500μL100纳米，在目前的实验LTB 4），并保持溶液中的微枪头，并允许进入微量加样器（回填土）的解决方案。
- 取1毫升配体和进入注射器（1毫升结核菌素注射器），慢慢地填写使用微量加样器，从顶部的微填写针（MF 28G - 5，世界精密仪器）的配体。
- 将油管，紧固移液器吸液管和管针（21 G，11 / 2）1 mL注射器，这是与配体填充。
- 现在，仔细地将微量移液器显微镜阶段和修复填充到微型机器人的配体。
- 申请从注射器小的压力，以确保配体是慢慢从针尖释放。
- 带镀不成熟BMDCs显微镜，并继续加热板（37℃）阶段。
- 删除氟盘的盖子。
- 使用油浸60X物镜聚焦细胞。
- 小心地装入吸管使用“粗手动机器人MN - 188NE细胞附近的配体。
- 聚焦使用“液压精细的微操作机器人MN - 188东北”的吸管。
- 申请从注射器小的压力，以确保配体释放入菜。
- 设置图像采集参数，以获得明亮的申请在每15秒（10毫秒曝光），2小时使用MetaMorph软件。
- 随时监控每30分钟的公关ogression对配体的迁移。
- 如果在拥挤枪头的细胞，改变针尖的位置，在该板块继续实验的迁移。
B.测量G蛋白偶联受体（BLT1）和胞浆蛋白（β- arrestin的）相互作用，在活细胞易位
1。质粒DNA结构的制备
DNA质粒结构的详细描述在加拉等人 （2005年）18。
2。人力BLT1 RFP和β- arrestin的- GFP的转染RBL - 2H3细胞
- 保持大鼠嗜碱性Leukomia（RBL - 2H3）细胞（60％至70％汇合）在37 ° C的95％空气加湿气氛中，5％的CO 2作为生长介质的单层培养（15％胎牛血清，2补充的DMEM MM L -谷氨酰胺，100 U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素在T75烧瓶）。
- 从菜/烧瓶细胞分离使用6毫升的胰蛋白酶- EDTA（0.05％胰蛋白酶，0.53毫米EDTA）和孵化5分钟，在37 °在95％空气饱和湿度，5％的CO 2 。轻轻摇动烧瓶监察支队细胞的程度。
- 添加6毫升培养基含有胰蛋白酶- EDTA 6毫升的容量瓶中，并收集细胞混合移液器上下多次。转移到细胞15毫升猎鹰管。
- 使用血球计数细胞，在15 mL离心管和离心3分钟和200μL转染介质中的悬浮480克RPM（DMEM培养液，20％FBS，50毫米的HEPES）4 × 10 6细胞。如果您计划执行3转染，准备相应的细胞和转染媒体，增加细胞数量和转染介质的体积。
- 准备至少为1.5μg/μL的浓度转染质粒。我们准备通过使用QIAGEN公司马克西DNA质粒试剂盒的DNA质粒。新增的个人或两个人BLT1 - RFP（25微克）和β- arrestin1 - GFP（15微克）的质粒DNA编码的无菌电泳试管，（BIO - RAD＃16552088），其中有0.4厘米的电极间隙。
- 取200μL上述悬浮细胞，并含有要么hBLT1 RFP或β- arrestin1 - GFP或两者一起试管，轻轻混合，用1 mL无菌吸管。
- 留在室温为10分钟以上的试管。
- Electroporate细胞基因脉冲电压250 V和500μF的能力。
- 后电击让细胞停留在室温为10分钟。
- 取1 mL的正常生长培养基，在试管电穿孔细胞混合。
- 分配到35毫米组织玻璃底培养皿中含有2毫升的正常生长介质（氟菜，世界精密仪器），这种混合物300μL孵育1小时在95％的空气加湿的气氛在37 ° C，5％CO 2。允许细胞坚持以盘底部。
- 更换后孵育1 h，用正常生长介质的媒体，让他们成长在37 ° C在95％空气饱和湿度，5％CO2培养箱中培养18-24小时。
3。活细胞成像
收购的图像
- 18-24小时后，用2毫升含10毫米HEPES，pH值7.55（直接加入2毫升暖媒体板和吸媒体重复2〜3次）温暖的无酚红的RPMI细胞2或3倍。添加1.8毫升，含10毫米的HEPES温暖的无酚红的RPMI。
- 30毫米的玻璃盖玻片底培养皿中含有RBL - 2H3细胞，转染hBLT1 RFP和加热显微镜阶段的β- arrestin1 - GFP（37℃）。
- 600X放大倍率，使用60 X客观尼康计划阿婆60X/1.4数值孔径油浸镜头（可在我们的显微镜系统）收集的细胞图像。
- 60 ×客观透镜放在一滴油，重点与常规明场细胞传送光，触摸盘底。
- 监察转蛋白的荧光，荧光过滤器（RFP的过滤器，如果你想看到受体或GFP，如果你想看到β- arrestin1）从明亮的领域（透射光）切换到。
- 选择明亮而健康的细胞，这hBLT1 - RFP的表达对细胞表面使用RFP的过滤器和捕获图像。
- 然后转移到GFP的过滤器，确保在细胞质中的β- arrestin的- GFP的表达和捕捉图像。然后都是伪彩色图像，捕获时间失效前活细胞图像，以确保通过荧光流血未服用RFP和GFP之间发生。
- 一旦你的手机选择，设置参数，根据你的目的使用软件（Metamorph软件在这种情况下）。
- 在目前的示范，16个位图像的来收购RA分级设置为1 × 1 60 X客观尼康计划阿婆60X/1.4数值孔径油浸镜头相结合。
- 收集30秒的时间间隔（如果易位/相互作用太快，一方面可以减少的时间间隔）MetaMorph软件控制这些使用滤光轮同时RFP和GFP荧光的荧光图像。
- RFP和GFP，相机的曝光时间设置为1000毫秒。 （根据RFP和GFP的荧光强度，设置特定的曝光时间）。
- 没有加入配体，它为0的时间点，首先收集1分钟的图像。
- 1分钟后，而不会干扰盘/或单元格的位置，添加配体的200μL（股票从10微米至终浓度为1μm）。
- 60分钟后，加入配体荧光图像采集，存储为TIFF图像文件名的顺序增加。
- 所有这些文件都可以作为与使用该软件的时间邮票的个人/组合荧光图像的堆栈文件。
图像和定量荧光蛋白质和本地化的过程
- RFP和GFP荧光过滤器与普通介质（无细胞）的图像采集，并保存为背景图像。使用这些图像中减去从上面获得的实际数据图像。
- RFP和GFP图像单独准备的图像的堆栈。
- 选择/确定各地区（表面VS胞质）来衡量RFP和GFP的荧光强度（BLT1和β- arrestin的易位）
- 剧情作为时间的函数量的荧光强度。该图将提供有关的特定分子的易位动力学的信息。
代表性的成果
A.测量白三烯 B 4导演的树突状细胞迁移
在本议定书中所描述的方法使用，以确定对树突状细胞白三烯 B 4（图1和附视频 1）21的迁移。我们可以运用类似的方法，以确定细胞趋化的能力，特别是在活细胞配体。
图1。小鼠骨髓衍生树突状细胞的迁移，对100纳米的 LTB 4。
视频1。活细胞迁移对LTB 4 BMDCs。 点击这里看录像 。
B.测量G蛋白偶联受体（BLT1）和胞浆蛋白（β- arrestin的）相互作用，在活细胞易位
此过程完成后，可以得到以下信息在G蛋白偶联受体信号事件。
- GPCR和胞浆蛋白和细胞核的定位（图2）。
- 配体诱导的相互作用的表面G蛋白偶联受体（在这种情况下BLT1）与胞浆蛋白（β- arrestin的在这种情况下）（图3）。
- 其次是膜受体的内化和β- arrestin的易位动力学的内化受体（图4）的（ 贝特贾拉等 。2005）18 。
- 人能确定在活细胞配体依赖的受体激活状态（附视频2），并确定关键的图案，或在受体激活的（ 贝特贾拉等。2005 ）18的进程。
图2。BLT1 - RFP（一），β- arrestin的GFP（二），pNuc - CFP（三）到RBL - 2H3细胞中的表达。颜色相结合的图像显示面板D.
图3配体受体和β- arrestin的诱导易位。在细胞内的荧光强度的线扫描显示。
图4。动力学后，除1微米的LTB 4受体的内化和β- arrestin的易位。的荧光强度进行测量的时间在膜和细胞的胞质地点的功能。
视频2 BLT1 - RFP和β- arrestin的- GFP的表达后，除了1微米的LTB 4的细胞的实时成像。点击这里观看视频
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
活细胞成像是一个强大的工具，表现出特定的蛋白质的功能和互动，因为他们在实时发生。在这个手稿中描述的方法，清楚地表明，LTB 4能诱导树突状细胞的快速迁移。这些方法不仅扩大LTB 4个功能多样的细胞类型方面，它们允许类似的方法被应用到其他各种趋化因子和测试他们在不同的白细胞分人口趋化剂的功效。在这个系统中的荧光成像，可以实时监测的信号事件。此外，这些方法可能也可以延伸检查体内分子的紧密关联，通过荧光共振能量转移（FRET）使用标记分子适当flurochromes。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是由美国国立卫生赠款AI - 52381，CA138623和肯塔基州的肺癌研究委员会和机构支持从格雷厄姆詹姆斯布朗癌症中心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells. | ATCC | CRL-2256 | |
| Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| Phenol red free RPMI or DMEM | Invitrogen | 11835-030 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin (10000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300 | |
| HEPES (1M) | Invitrogen | 15630 | |
| 35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | |
| Gene Pulser II electroporater | Bio-Rad | ||
| TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300 | Nikon Instruments | ||
| Metamorph Software | Universal Imaging | ||
| Vertical Micro-pipette puller | Narishige International | ||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | ||
| Hadraulic Micromanipulator MO-188NE | Narishige International | ||
| Coarse Manual Manipulator, MN-188NE | Narishige International | ||
| cDNA constructs: | |||
| cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP) | Jala et al 2005 | ||
| cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study). | Jala et al 2005 |
References
- Wess, J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 11, 346-354 (1997).
- Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors. Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J.
- Lefkowitz, R. J. G. protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization. J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).
- Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling. Biochem J. 375, 503-515 (2003).
- Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines. Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).
- Tager, A. M., Luster, A. D. BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).
- Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T.
- Haribabu, B. Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis. J Exp Med. 192, 433-438 (2000).
- Subbarao, K. Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators. Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).
- Heller, E. A. Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment. Circulation. 112, 578-586 (2005).
- Miyahara, N. Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).
- Terawaki, K. Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses. J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).
- Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice. J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J Exp Med. 203, 829-835 (2006).
- Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors. J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells. Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).
- Del Prete, A., A, Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function. Blood. 109, 626-631 (2007).
- Salogni, L. Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14. Blood. 113, 5848-5856 (2009).
- Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J Vis Exp. , (2008).
