Summary
Эта статья описывает методологию для определения хемотаксиса лейкоцитов ответ на специфических лигандов и определить взаимодействие между рецепторами клеточной поверхности и цитозольного белков с использованием живых методов визуализации клеток.
Protocol
Методология
Описание микроскоп
Живая клетка экспериментов изображений производится с помощью FM-TE-эпи-флуоресценции систему, подключенную к инвертированный микроскоп Nikon Eclipse, TE300. Микроскоп оснащен отопления стадии. Прохладный оснастки HQ цифрового Ч / Б CCD (Roper Scientific) камеры и LAMDA 10-2 оптический фильтр чейнджер (Саттер инструмент компании) крепится к микроскопа. Возбуждение и излучение длиной волны контролируются с фильтром колеса и контролируется Ламба 10-2 фильтр контроллер колесо, Саттер инструменты Co Выдержка 500 мс должно быть достаточно, чтобы посмотреть в ППП или GFP в живых клетках. Аппаратное управление и получение изображений находятся под контролем программного обеспечения Метаморф. Выбор фильтров для настоящего исследования, наборы фильтров S480/20x, S525/40m и S565/25x, S620/60m для GFP и RFP, соответственно; EGFP / DsRed двойной дихроичных, Chroma Technology. Этот фильтр колесо может вместить до шести наборов фильтров. Микроскоп крепится До Проскан контроллер сцене с Джойстик. Все эти вложения аппаратных можно управлять с помощью программного обеспечения Метаморф. Микроскоп также прилагается с Микроманипуляторы провести микропипетки.
А. Измерение лейкотриена B 4 Режиссер Дендритные миграции клеток
Использование описанных выше микроскопом настройки, мы разработали методы для следующих лиганд направлена дендритных миграции клеток в реальном времени. Два микроманипуляторами (Narishige) прикреплены к микроскопа. Хемотаксис костного мозга мышей дендритных клеток (BMDCs) к LTB 4 градиент был записан. Здесь мы опишем методы для подготовки микро-пипетки с использованием микро-пипетки съемник, погрузка лиганда в микро-пипетки и настройка хемотаксис эксперимент на нагревательный столик микроскопа для контроля направленной миграции клеток. Этот метод может быть применен для проверки эффективности различных хемоаттрактантов в стимулировании миграции, а также эффект ингибиторов хемотаксиса в живых клетках. Изоляция BMDCs 21 от мыши был описан в ряде публикаций, включая Юпитер 22.
1. Подготовка BMDCs
- Пластина BMDCs (после культивирования в течение 10 дней) на нижней крышке блюдо фтор скольжения и дать им возможность расти в течение 16 ч перед экспериментом.
- Вымойте клеток с 3 мл 1X PBS по крайней мере в 2 раза (добавляя 3 мл 1X PBS к плите и аспирационных буфере).
- Добавить 2 мл 1XPBS к пластине. Клетки готов к эксперименту. Держите клеток в 37 ° С инкубатор до эксперимента.
Подготовка лиганд загружены микропипетки:
- Fix стеклянные капилляры (стекло стандарт, 0,75 мм х 0,4 мм, 6 ", Cat # 625500, А. М. Systems, INC) на вертикальной микропипетки съемник (Narishige Международный США, Inc).
- Поддерживать температуру 52 ° С и позволяют стекла для плавления и растащить по форме острия края.
- Fix пипетки на микро-пипетки держателя.
- Гладкая острые углы микропипетки использованием Micro подделать М-900 (Narishige International США, Inc), наблюдая под микроскопом.
- Подготовка по крайней мере 10-20 пипетки для каждого эксперимента. Примечание: микропипетки также можно приобрести от Всемирного точных приборов (μ TIP, T1801TW1F).
- Возьмите желаемой концентрации (500 мкл 100 нМ LTB 4 в текущем эксперименте) лиганда в 1 мл effendorf трубку и держать микро кончика пипетки в растворе и, чтобы раствор вступает в микропипетки (засыпка).
- Принимать по 1 мл лиганда и в шприц (1 мл туберкулиновые шприцы) и медленно заполнить лиганд использованием микро-Fill иглы (28G MF-5, инструменты Всемирного Precision) в микропипетки сверху.
- Прикрепите трубку, которая плотно прилегает к пипеткой пипетки и трубки иглы (21 G 11 / 2) прилагается к 1 мл шприца, который наполнен лиганда.
- Теперь, осторожно двигаться лиганд заполнены микро-пипетки на столик микроскопа и закрепить на микро-манипуляторов.
- Примените немного давление со шприца, чтобы убедиться, лиганд медленно выпуская из наконечника.
- Принесите покрытием незрелых BMDCs к микроскопу и держать их на обогреваемой пластине (37 ° C) стадии.
- Удалите крышку фтор блюдо.
- Фокус клеток с использованием масляной иммерсии 60X объектива.
- Осторожно, сбить лиганд загружены пипетки с помощью "грубой Руководство Манипулятор MN-188NE к близости клеток.
- Фокус пипетки с помощью "Гидравлические изобразительных микроманипулятора MN-188 NE '.
- Примените немного давление со шприца, чтобы убедиться, что лиганд выпускает в блюдо.
- Установите параметры получения изображений приобрести в ярко поданные (10 мс экспозиции) в каждые 15 секунд в течение 2 часов использования Метаморф программного обеспечения.
- Держите мониторинг каждые 30 мин для прogression миграции к лиганд.
- Если ячейки переполнены на кончике пипетки, изменить расположение кончика в пластине для продолжения миграции эксперимента.
В. Измерение GPCR (BLT1) и цитозольного белка (β-arrestin) взаимодействий, транслокации в живых клетках
1. Подготовка плазмидной конструкции ДНК
Детали ДНК плазмиды конструкции были описаны в Джала и соавт. (2005) 18.
2. Трансфекция по правам BLT1-ППП и β-Arrestin-GFP в RBL-2H3 Клетки
- Поддерживать Крыса базофильных Leukomia (RBL-2H3) клетки (от 60 до 70% слияния) при 37 ° C во влажной атмосфере на 95% из воздуха, 5% СО 2, как монослой культур в питательной среде (DMEM дополнена с 15% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл, стрептомицин) в колбах T75.
- Отсоедините клетки блюда / колбы с помощью 6 мл трипсина-EDTA (0,05% трипсина, 0,53 мМ ЭДТА) и инкубации в течение 5 мин при 37 ° C во влажной атмосфере 95% воздуха, 5% СО 2. Осторожно встряхните колб для мониторинга масштабов отрыва клеток.
- Добавить 6 мл питательной среды в колбе, содержащей 6 мл трипсина-EDTA и собирают клетки, смешивая их с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Передача клеток в 15 мл труб сокола.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра и принимать 4 х 10 6 клеток в 15 мл центрифужные пробирки и центрифуги на 480 г оборотов в минуту в течение 3 минут и ресуспендируют в 200 мкл трансфекции СМИ (DMEM, 20% FBS, 50 мМ HEPES). Если вы планируете выполнять 3 трансфекции, подготовить клетки и tranfection СМИ соответственно за счет увеличения числа клеток и объема трансфекции среду.
- Подготовка плазмиды для трансфекции в концентрации не менее 1,5 мкг / мкл. Мы готовим ДНК плазмиды с помощью QIAGEN Maxi ДНК плазмиды комплект. Добавить лицо или как плазмиды, кодирующей ДНК для человека BLT1-RFP (25 мкг) и β-arrestin1-GFP (15 мкг) в стерильную кювет электрофореза (Bio-Rad # 16552088), который имеет 0,4 см зазор между электродами.
- Возьмите 200 мкл выше ресуспендировали клетки и поместить их в кювет, содержащих либо hBLT1-RFP или β-arrestin1-GFP или оба вместе и смешивать их осторожно с 1 мл стерильной пипеткой.
- Оставьте выше кювет при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Electroporate клеток в генной Pulser II с напряжением 250 В и емкостью 500 мкФ.
- После электропорации позволяют клеткам оставаться при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Принимать по 1 мл регулярной среде рост и смешать его с электропорации клеток в кювет.
- Распределить 300 мкл этой смеси на 35 мм ткани со стеклянным дном культуры блюда (фтористый блюдо, инструменты Всемирного Precision), содержащий 2 мл регулярных средах роста и инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 ° C во влажной атмосфере на 95% из воздуха, 5% СО 2. Разрешить клетки придерживаться нижней части блюда.
- Замените средств массовой информации после 1 ч инкубации с регулярными питательной среды и позволяют им расти при температуре 37 ° C во влажной атмосфере на 95% из воздуха, 5% СО 2 инкубатора в течение 18-24 часов.
3. Живая изображениями сотовый
Приобретение изображений
- После 18-24 часов, промыть клетки 2 или 3 раза с 2 мл теплой фенола красного свободной RPMI, содержащего 10 мМ HEPES, рН 7,55 (Добавить 2 мл теплой медиа непосредственно в тарелку и аспирации СМИ. Повторите 2 или 3 раза). Добавить 1,8 мл теплого фенола красного свободной RPMI, содержащего 10 мМ HEPES.
- Место 30 мм стекло покровное дном культуры блюд, содержащих RBL-2H3 клеток, трансфицированных hBLT1-ППП и β-arrestin1-GFP на нагревательный столик микроскопа (37 ° С).
- Сбор ячейка изображения при увеличении 600x с использованием 60 X цель Nikon Plan Apo 60X/1.4 числовой апертурой нефти погружения линз (в нашем микроскопе системы).
- Положите одну нефть упасть на 60 линзы цель х и сосредоточиться клетки с регулярными светлое поле проходящего света, прикоснувшись к нижней части пластины.
- Для контроля за флуоресценцию трансфекции белков, переход от светлого поля (проходящий свет) на флуоресцентный фильтр (RFP фильтр, если вы хотите увидеть рецепторов или GFP, если вы хотите увидеть β-arrestin1).
- Выберите яркие и здоровые клетки, которая выражает hBLT1-RFP на клеточной поверхности с помощью ППП фильтр и захвата изображений.
- Затем переход к GFP фильтр и убедиться, что β-arrestin-GFP выражается в цитоплазме и захвата изображений. Потом псевдо цвета и образы, перед съемкой время, прошедшее изображения в реальном времени клетка, чтобы убедиться, что кровотечение через флуоресценции не принимает, возникающие между ППП и GFP.
- После выбора мобильного сделал, установить параметры согласно вашей цели с помощью программного обеспечения (Software Метаморф в данном случае).
- В нынешней демонстрации, шестнадцать битных изображений приобретаются пришелра биннинга установлен в 1 X 1 в сочетании с 60 X цель Nikon Plan Apo 60X/1.4 числовой апертурой нефти погружения линз.
- Сбор флуоресцентные изображения для ППП и GFP флуорохромами одновременно на 30 сек интервал времени (если транслокация / взаимодействия являются слишком быстро, можно уменьшить интервалы времени) из них с помощью фильтра колеса управляемые программным обеспечением Метаморф.
- Раз экспозиции камеры установлен в 1000 мс для ППП и GFP. (Установите определенное время воздействия в соответствии с флуоресцентной интенсивности ППП и GFP).
- Первый сбор изображений в течение 1 мин без добавления лиганда, который служит в качестве временной точке 0.
- Добавить 200 мкл лиганда (со склада в 10 мкМ до конечной концентрации 1 мкМ) через 1 мин, не нарушая пластина / или сотовый позиции.
- Флуоресцентные изображения собираются в течение 60 мин после добавления лиганда и хранится в виде изображений TIFF с возрастающим порядком имен файлов.
- Все эти файлы могут быть сделаны как стек файлы с отдельными / комбинированной флуоресцентные изображения с метками времени с помощью программного обеспечения.
Процесс изображения и количественное определение флуоресценции белков и локализации
- Приобретать изображений с простым СМИ (без клеток) с ППП и GFP флуоресцентных фильтров и сохранить их в качестве фоновых изображений. Используйте эти образы вычесть из реальных изображений данные, полученные выше.
- Подготовка стека изображений индивидуально для ППП и GFP изображений.
- Выбор / определяем различных регионах (против цитозольного поверхности) для измерения интенсивности флуоресценции ППП и GFP (BLT1 и β-arrestin транслокации)
- Участок сумма интенсивности флуоресценции как функция времени. Этот график будет предоставлять информацию о кинетике транслокации данной молекулы.
Представитель Результаты
А. Измерение лейкотриена B 4 Режиссер Дендритные миграции клеток
Метод, описанный в этом протоколе была использована для определения дендритных миграции клеток к лейкотриен B 4 (рис. 1 и прилагается видео 1) 21. Мы можем применить аналогичные методологии для определения хемотаксиса способности клеток к определенному лиганд в живых клетках.
Рисунок 1. Костного мозга мышей дендритных миграции клеток к 100 нм LTB 4.
Видео 1. Живая клетка миграции BMDCs к LTB 4. Нажмите здесь для просмотра видео .
В. Измерение GPCR (BLT1) и цитозольного белка (β-arrestin) взаимодействий, транслокации в живых клетках
По завершении этой процедуры, можно получить следующую информацию в GPCR сигнальных событий.
- Локализация GPCR и цитозольного белков и ядра (рис. 2).
- Лиганд индуцированного взаимодействия поверхностных GPCR (BLT1 в данном случае) с цитозольного белка (β-arrestin в данном случае) (рис. 3).
- Кинетика интернализация рецепторов и β-arrestin транслокации к мембранным следуют интернализации вместе с рецепторами (рис. 4) (Джала и соавт. 2005) 18.
- Можно определить лиганд зависимый статус активации рецепторов в живых клетках (прилагается видео-2) и определения критических мотивов или процессы активации рецептора (Джала и соавт. 2005) 18.
Рисунок 2. Выражение BLT1-RFP (А), β-arrestin-GFP (Б), pNuc-CFP (С) в RBL-2H3 клеток. Цвет комбинированное изображение показано на панели D.
Рисунок 3. Лиганд индуцированных транслокации рецепторов и β-arrestin. Линия сканирования флуоресцентных интенсивности в клетки показано на рисунке.
Рисунок 4. Кинетика интернализация рецепторов и β-arrestin транслокации при добавлении 1 мкМ LTB 4. Интенсивности флуоресценции измеряли как функцию времени на мембране и цитоплазме местах клетки.
Видео 2 Live изображений клеток, экспрессирующих BLT1-ППП и β-arrestin-GFP при добавлении 1 мкМ LTB 4. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Живая клетка изображений является мощным инструментом для демонстрации функции и взаимодействие специфических белков, как они происходят в режиме реального времени. Методы, описанные в этой рукописи ясно показывают, что LTB 4 может вызвать быструю миграцию дендритных клеток. Эти методы не только расширить аспекты LTB 4 функции разнообразных типов клеток, они позволяют подобные методы, применяемые к ряду других хемокинов и тестирования их эффективности в качестве агентов на хемотаксиса лейкоцитов различных суб населения. Флуоресценции в этой системе позволяет контролировать сигнальных событий в режиме реального времени. Кроме того, эти методы могут быть расширены для изучения плотно ассоциации молекул в естественных условиях, следуя флуоресценции передачи энергии резонанса (FRET) с использованием соответствующих flurochromes оснащенных молекул.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Исследование поддержано Национальным институтом здоровья гранты АИ-52 381, CA138623 и Кентукки рака легких совета исследований и организационной поддержке со Джеймс Грэм Браун онкологический центр.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells. | ATCC | CRL-2256 | |
| Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| Phenol red free RPMI or DMEM | Invitrogen | 11835-030 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin (10000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300 | |
| HEPES (1M) | Invitrogen | 15630 | |
| 35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | |
| Gene Pulser II electroporater | Bio-Rad | ||
| TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300 | Nikon Instruments | ||
| Metamorph Software | Universal Imaging | ||
| Vertical Micro-pipette puller | Narishige International | ||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | ||
| Hadraulic Micromanipulator MO-188NE | Narishige International | ||
| Coarse Manual Manipulator, MN-188NE | Narishige International | ||
| cDNA constructs: | |||
| cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP) | Jala et al 2005 | ||
| cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study). | Jala et al 2005 |
References
- Wess, J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 11, 346-354 (1997).
- Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors. Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J.
- Lefkowitz, R. J. G. protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization. J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).
- Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling. Biochem J. 375, 503-515 (2003).
- Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines. Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).
- Tager, A. M., Luster, A. D. BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).
- Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T.
- Haribabu, B. Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis. J Exp Med. 192, 433-438 (2000).
- Subbarao, K. Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators. Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).
- Heller, E. A. Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment. Circulation. 112, 578-586 (2005).
- Miyahara, N. Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).
- Terawaki, K. Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses. J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).
- Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice. J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J Exp Med. 203, 829-835 (2006).
- Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors. J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells. Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).
- Del Prete, A., A, Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function. Blood. 109, 626-631 (2007).
- Salogni, L. Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14. Blood. 113, 5848-5856 (2009).
- Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J Vis Exp. , (2008).
