Summary
本論文では、特定のリガンドへの白血球の走化性応答を決定し、生細胞イメージング技術を用いて細胞表面の受容体と細胞質のタンパク質間の相互作用を識別するための方法論を説明します。
Abstract
G -タンパク質共役受容体（GPCR）は7回膜貫通型タンパク質ファミリーに属し、細胞内応答する細胞外シグナルの伝達を媒介する。 GPCRの制御などの走化性、細胞内カルシウムの放出、ヘテロ三量体G -タンパク質1から2を介してリガンド依存的に遺伝子の調節など、多様な生物学的機能。リガンドの結合は、そのようなサイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）、イノシトール三リン酸（IP3）とジアシルグリセロール（DG）などのセカンドメッセンジャーのレベルを調節するヘテロ三量体G -タンパク質の活性化につながる立体構造変化のシリーズを誘導する。受容体のリガンド結合の活性化との併用はまた脱感作、隔離および/または内在化を介したシグナル受容体を減衰させる一連のイベントを開始します。 GPCRの脱感作のプロセスは、G -タンパク質の受容体キナーゼ（GRKs）とβ-アレスチン3のその後の結合による受容体のリン酸化を介して行われます。 β-アレスチンは、細胞質タンパク質であり、受容体の内在化4-6容易にすることで、そこに（ほとんどの場合）リン酸化受容体に結合し、GPCRの活性化によって細胞膜に転位する。
とLTB 4受容体2（BLT2、低親和性受容体、ロイコトリエンB 4（LTB 4）GPCRの、LTB 4受容体1（高親和性受容体BLT1）を介してアラキドン酸経路と媒介する、その行動から派生した炎症誘発性脂質分子である）7-9。 LTB 4 - BLT1経路は、喘息、関節炎、アテローム性動脈硬化症10-17日 、など、いくつかの炎症性疾患において重要であることが示されている。現在の紙は、LTB 4誘発性白血球遊走およびβ-アレスチンと、顕微鏡イメージング技術の18から19を用いて生細胞における受容体の転座を持つBLT1の相互作用を監視するために開発した方法論を説明します。
C57BL / 6マウスから樹状細胞を骨髄由来は、前述の20〜21として単離し、培養した。これらの細胞は、LTB 4による細胞遊走を示すために、生細胞イメージング法で試験した。人間のBLT1は、C -末端に赤色蛍光タンパク質（BLT1 - RFP）を付けられ、β- arrestin1は、緑色蛍光タンパク質（β- ARR - GFP）で標識し、ラット好塩基球Leukomia（RBL - 2H3）細胞株に両方のプラスミドをトランスフェクトした18-19これらのタンパク質とローカリゼーション間の相互作用のカイネティクスは、ライブセルビデオ顕微鏡を用いてモニターした。現在の論文の方法論は、生細胞におけるGタンパク質共役型受容体の機能的応答を調べるために顕微鏡技術の使用を説明しています。現在の紙はまた、受容体の動態と細胞質蛋白質の相互作用を決定するために蛍光強度を定量化するMetamorphソフトウェアの使用を説明します。
Protocol
方法
顕微鏡の説明
ライブセルイメージング実験では、Eclipse TE300ニコン倒立顕微鏡に接続されたTE - FM落射蛍光システムを使用して実行。顕微鏡は、加熱ステージを装備。クールなスナップHQデジタルB / W CCD（ローパーサイエンティフィック）カメラとLAMDA 10月2日光学フィルターチェンジャー（サター機器の会社）は、顕微鏡に接続されている。励起および発光波長はフィルタホイールで制御し、ランバ10月2日フィルタホイールコントローラによって制御される、サターインスツルメンツ（株）露光時間500 msは、生細胞でのRFPまたはGFPを表示するには十分なはずです。ハードウェアの制御や画像の取得は、Metamorphソフトウェアによって制御されます。 EGFP / DsRedをデュアルダイクロイック、クロマテクノロジー、本研究のためのフィルタの選択は、フィルタはS480/20x、S525/40mとS565/25x、GFPとRFPのためS620/60m、それぞれを設定している。このフィルターホイールは、6つのフィルターセットを収容することができます。顕微鏡は、ジョイスティックとの事前PROSCANステージコントローラに添付されます。これらのすべてのハードウェアの添付ファイルは、Metamorphソフトウェアによって制御することができます。顕微鏡は、マイクロピペットを保持するためにマイクロマニピュレータで添付されます。
A.は、ロイコトリエンB 4演出樹状細胞の遊走を測定
上記の顕微鏡の設定を使用して、我々はリアルタイムで樹状細胞の遊走を指示、以下のリガンドのためのメソッドを開発しました。二つのマニピュレーター（成茂）は、顕微鏡に接続されている。 LTB 4勾配に向かってマウス骨髄由来樹状細胞（BMDCs）の走化性を記録した。ここで、我々は、マイクロピペットへの配位子をロードすると、細胞の方向性のある移動を監視するために顕微鏡の加熱ステージ上の走化性の実験を設定する、マイクロピペットプラーを使用して、マイクロピペットを準備する方法を説明します。このメソッドは、移行だけでなく、生細胞の走化性の阻害剤の効果を誘導で明確な化学誘引物質の有効性をテストするために適用することができます。マウスからBMDCs 21の単離は、Joveの22を含むいくつかの刊行物に記載されています。
1。 BMDCsの準備
- カバースリップの下のフッ素皿にし、それらを先に実験の16時間成長させる上でプレートはBMDCs（10日間培養後）。
- 少なくとも2回は、（プレートに1 × PBSを3mlを加えるとバッファーを吸引によって）の1X PBS 3mLで細胞を洗浄。
- プレートに1XPBS 2 mlを加え。セルは実験のための準備が整いました。 ℃のインキュベーター前の実験への37の細胞を保つ。
マイクロピペットをロードしたリガンドの調製：
- 垂直マイクロピペットプラー（成茂インターナショナル米国社）上に、ガラスキャピラリーチューブ（6"、カタログ番号625500、AMシステムズ、INCガラス標準、0.75ミリメートル× 0.4 mm）を修正。
- 52に温度を保つ℃、ガラスは鋭いエッジの先端を形成するために溶融し、離れてプルすることができます。
- マイクロピペットホルダーの上にピペットを修正。
- M - 900（成茂インターナショナル米国、Inc）を顕微鏡下で見て、マイクロフォージを使用して、マイクロピペットのギザギザを滑らかに。
- 各実験のために少なくとも10-20ピペットを準備します。注：マイクロピペットは、世界の精密機器（μのTIP、T1801TW1F）から購入することができます。
- 1 mLのeffendorf管に配位子の所望の濃度（現在の実験では100 nM LTB 4の500μL）を取ると、溶液中のマイクロピペットの先端を維持し、解決策は、マイクロピペット（埋め戻し）に入力することができます。
- リガンドのとシリンジ（1ccのツベルクリン注射器）に1 mLをとり、ゆっくりと上からマイクロピペットへのマイクロフィル針を（MF 28G - 5、世界の精密機器）を使用してリガンドを埋める。
- ピペットと配位子で満たされている1 mLシリンジに取り付けられた針（21 G 11 / 2）のチューブにピペットにしっかりフィットするチューブを、取り付けます。
- 今、注意深く顕微鏡のステージに、マイクロピペット充填した配位子を移動して、マイクロマニピュレータに固定する。
- 配位子が徐々に先端から放出されていることを確認するために注射器から少し圧力を適用する。
- 顕微鏡にメッキ未熟BMDCsを持参し、加熱されたプレート（37 ° C）の段階でそれらを保つ。
- フッ素皿のふたを取り外します。
- 油浸60X対物レンズを使用してセルをフォーカス。
- 慎重に、細胞の近傍に"粗マニュアルマニピュレータMN - 188NE"を使用してピペットをロードしたリガンドをダウンさせる。
- "油圧ファインマイクロMN - 188 NE"を使用してピペットフォーカス。
- 配位子が皿に解放されていることを確認する注射器から少し圧力を適用する。
- Metamorphソフトウェアを使用して2時間ごとに15秒で（10ミリ秒の露出）に提出明るいで取得する画像取得のパラメータを設定します。
- PRのため30分ごとに監視し続ける配位子への移行のogression。
- 細胞をピペットチップで混雑している場合は、実験の移行を継続するために板の先端の位置を変更する。
B.測定GPCR（BLT1）と細胞質タンパク質（β-アレスチン）の相互作用、生細胞における転
1。プラスミドDNAコンストラクトの調製
DNAプラスミド構築の詳細はJala ら （2005）18で説明された。
2。 RBL - 2H3細胞へのヒトBLT1 - RFPおよびβ-アレスチン- GFPのトランスフェクション
- 増殖培地で単層培養として、95％空気の加湿雰囲気下でC 37℃、5％CO 2をラット好塩基球Leukomia（RBL - 2H3）細胞を（60から70パーセントコンフルエンス）維持する（DMEM、15％FBSを添加した、2 T75フラスコ中mMのL -グルタミン、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシン）。
- トリプシン- EDTA（0.05％トリプシン、0.53 mMのEDTA）6 mLを用い、37℃で5分間インキュベートすることにより、ディッシュ/フラスコから細胞を剥離〜95％空気の加湿雰囲気下でC、5％CO 2。静かに細胞の剥離の程度を監視するためにフラスコを振る。
- トリプシン- EDTAの6 mLを入れたフラスコに増殖培地6 mLを追加し、複数回上下にピペッティングして混合して細胞を集める。 15 mLのファルコンチューブに細胞を移す。
- 血球計算板を用いて細胞をカウントし、トランスフェクション媒体の200μLで3分間再懸濁します（DMEM、20％FBS、50mMのHEPES）のために480グラムrpmで15 mLの遠心チューブと遠心分離機で4 × 10 6個の細胞を取る。あなたが3トランスフェクションを実行する場合は、細胞数およびトランスフェクション培地の量を増やすことによって、それに応じて細胞とトランスフェクションのメディアを準備する。
- 少なくとも1.5μg/μLの濃度でトランスフェクトされるプラスミドを準備します。我々は、QIAGENのマキシのDNAプラスミドキットを用いてプラスミドDNAを準備する。 0.4センチメートル電極ギャップを持つ無菌電気泳動のキュベット、（Bio - Rad社＃16552088）、に人間BLT1 - RFP（25μg）を、β- arrestin1 - GFPについては、個々のまたは両方のプラスミドをコードするDNA（15μg）を追加します。
- 上記の再懸濁した細胞を200μLを取ると一緒にhBLT1 - RFPまたはβ- arrestin1 - GFPまたは両方のいずれかを含むキュベットに置き、1 mLの滅菌ピペットで軽く混ぜる。
- 10分間、室温で上記のキュベットにしておきます。
- 電圧250 Vと容量500μFとジーンパルサーIIで細胞をエレクトロポ。
- エレクトロポレーション後、細胞を10分間室温で滞在ができます。
- 定期的な増殖培地1 mLをとり、キュベットにエレクトロポレーションした細胞と混ぜる。
- 、5％のCOを、通常の増殖培地2 mLを含む、35 mmの組織のガラス底の培養皿（フッ素料理、世界の精密機器）にこの混合物300μLを配布し、37℃で1時間インキュベート° Cを95％空気の加湿雰囲気下で2。細胞は皿の底に付着することができます。
- 定期的な増殖培地とのインキュベーションの1時間後にメディアを交換し、それらは37で成長できるように95℃％空気の加湿雰囲気下でC、5％CO 2インキュベーターを18〜24時間のために。
3。ライブセルイメージング
画像の取得
- 18から24時間後、10mMのHEPES、pHが7.55を（プレートと吸引のメディアに直接暖かいメディアの2 mlを加え2〜3回繰り返す）を含む暖かいフェノールレッドを含まないRPMI 2 mLで細胞を2〜3回洗浄する。 10mMのHEPESを含む暖かいフェノールレッドを含まないRPMIの1.8 mLを加え。
- hBLT1 - RFPおよび加熱顕微鏡のステージ上でβ- arrestin1 - GFP（37℃）でトランスフェクトしたRBL - 2H3細胞を、含んでいる場所30mmのガラスカバースリップ底培養皿。
- （私たちの顕微鏡システムで利用可能）60 X客観ニコンプランアポ60X/1.4開口数の油浸レンズを用いて600倍の倍率で、細胞の画像を収集する。
- 60 ×客観的なレンズの1つの油滴を入れて、プレートの底に触れることにより、通常の明視野透過光で細胞を集中する。
- トランスフェクトされたタンパク質の蛍光、蛍光フィルター（RFPフィルタ、あなたがβ- arrestin1を表示する場合は、受容体またはGFPを表示する場合）に、明視野（透過光）からスイッチを監視するには。
- RFPフィルタを使用して細胞表面上hBLT1 - RFPを発現し、イメージをキャプチャ明るく健康な細胞を、選択してください。
- その後、GFPフィルターにシフトし、β-アレスチン- GFPは細胞質で発現していることを確認し、イメージをキャプチャします。その後、擬似カラー、両方のイメージ、キャプチャ時間は蛍光の裏写りがRFPとGFPとの間に発生を取っていないことを確認するためのライブセルイメージを経過する前に。
- あなたの細胞の選択がなされると、ソフトウェア（このインスタンスでMetamorphソフトウェア）を使用して、目的に応じてパラメータを設定します。
- 現在のデモでは、16ビットの画像は来たで取得されていますRAのビニング1に設定する60 X客観ニコンプランアポ60X/1.4開口数の油浸レンズと組み合わせたX 1。
- Metamorphソフトウェアによって制御されるこれらの使用してフィルタホイールの30秒の時間間隔（転座/相互作用が速すぎる場合は、1つは時間間隔を減らすことができる）で同時にRFPとGFPの蛍光色素の蛍光画像を収集する。
- カメラの露光時間は、RFPとGFPのために1000ミリ秒に設定。 （RFPとGFPの蛍光強度に応じて、特定の露光時間を設定します）。
- 最初の0タイムポイントとして機能するリガンドを、追加せずに1分間の画像を収集する。
- プレート/または細胞の位置を乱すことなく、1分後のリガンドの200μL（10μMのストックから1μMの最終濃度まで）を追加します。
- 蛍光イメージは、ファイル名の昇順でリガンドを添加した後60分間に収集し、TIFF画像として保存されます。
- すべてのこれらのファイルは、ソフトウェアを使用してタイムスタンプを持つ個々の/複合蛍光画像とスタックファイルとして作ることができます。
画像とタンパク質と局在の蛍光の定量化のプロセス
- RFPとGFP蛍光フィルター付きのプレーンメディア（無細胞）を使用して画像を取得し、背景画像として保存します。上記で得られた実際のデータの画像から減算するこれらの画像を使用してください。
- RFPとGFPの画像ごとに個別の画像のスタックを準備します。
- RFPとGFPの蛍光強度（BLT1およびβ-アレスチン転座）を測定するために様々な領域（表面対細胞質ゾル）を選択/定義
- 時間の関数としての量が蛍光強度をプロットします。このグラフは、与えられた分子の移動の動力学に関する情報を提供します。
代表的な結果
A.は、ロイコトリエンB 4演出樹状細胞の遊走を測定
このプロトコールに記載されている方法は、ロイコトリエンB 4（図1と接続されているビデオ1）21に向かって樹状細胞の移動を決定するために使用された。我々は生きている細胞内の特定のリガンドに対する細胞の走化能力を決定するために同様の方法論を適用することができます。
100nMのLTB 4に向かって樹状細胞の遊走派生図1。マウスの骨髄。
ビデオは1。LTB 4に向かってBMDCsの細胞遊走をライブ。 ビデオを見るにはここをクリック 。
B.測定GPCR（BLT1）と細胞質タンパク質（β-アレスチン）の相互作用、生細胞における転
この手順の完了時に、人はGPCRシグナル伝達イベントに次の情報を得ることができます。
- GPCRとサイトゾルタンパク質と核の局在（図2）。
- リガンドは、細胞質タンパク質（この場合はβ-アレスチン）（図3）で表面GPCR（この場合はBLT1）の相互作用を誘導した。
- 受容体の内在化と受容体（図4）（Jala ら、2005）18と一緒にインターナリゼーションに続く膜にβ-アレスチン転座の動力学。
- 一つは、生細胞におけるリガンド依存性の受容体の活性化の状態を（ビデオ2添付）を決定し、受容体の活性化（Jala ら、2005）18に関与する重要なモチーフやプロセスを決定することができます。
図2。RBL - 2H3細胞にBLT1 - RFP（A）、β-アレスチン- GFP（B）、pNuc - CFP（C）の発現。パネルDに示すように、カラー合成画像
図3受容体とβ-アレスチンのリガンド誘発転座。細胞の蛍光強度のラインスキャンが表示されます。
図4。受容体の内在化と1μMLTB 4の添加によりβ-アレスチン転の速度論。蛍光強度は、膜と細胞の細胞質ゾルの場所で時間の関数として測定した。
1μMのLTB 4の添加によりBLT1 - RFPおよびβ-アレスチン- GFPを発現する細胞のビデオ2ライブイメージングは。 ビデオを見るにはここをクリック
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ライブセルイメージングが発生したときに、リアルタイムで特定のタンパク質の機能と相互作用を実証するために強力なツールです。この原稿で説明する方法は明らかにLTB 4は、樹状細胞の迅速な移行を誘導できることを示している。これらのメソッドは、唯一の多様な細胞型にLTB 4の機能の側面を展開していない、彼らは同じような方法が他のケモカインの様々に適用することができますし、別の白血球サブ集団での走化剤としての有効性をテストする。このシステムでの蛍光イメージングは、リアルタイムでのシグナル伝達事象を監視することができます。さらに、これらの方法はまた、適切なflurochromesタグ付けされた分子を用いた蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）に続くことによってin vivoでの分子の緊密な関連を調べるために拡張することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
研究は、健康補助AI - 52381、CA138623とケンタッキー肺癌研究会とジェームズグラハムブラウンがんセンターの施設支援の国立研究所によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells. | ATCC | CRL-2256 | |
| Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| Phenol red free RPMI or DMEM | Invitrogen | 11835-030 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin (10000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300 | |
| HEPES (1M) | Invitrogen | 15630 | |
| 35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | |
| Gene Pulser II electroporater | Bio-Rad | ||
| TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300 | Nikon Instruments | ||
| Metamorph Software | Universal Imaging | ||
| Vertical Micro-pipette puller | Narishige International | ||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | ||
| Hadraulic Micromanipulator MO-188NE | Narishige International | ||
| Coarse Manual Manipulator, MN-188NE | Narishige International | ||
| cDNA constructs: | |||
| cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP) | Jala et al 2005 | ||
| cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study). | Jala et al 2005 |
References
- Wess, J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 11, 346-354 (1997).
- Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors. Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J.
- Lefkowitz, R. J. G. protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization. J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).
- Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling. Biochem J. 375, 503-515 (2003).
- Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines. Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).
- Tager, A. M., Luster, A. D. BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).
- Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T.
- Haribabu, B. Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis. J Exp Med. 192, 433-438 (2000).
- Subbarao, K. Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators. Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).
- Heller, E. A. Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment. Circulation. 112, 578-586 (2005).
- Miyahara, N. Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).
- Terawaki, K. Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses. J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).
- Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice. J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J Exp Med. 203, 829-835 (2006).
- Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors. J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells. Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).
- Del Prete, A., A, Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function. Blood. 109, 626-631 (2007).
- Salogni, L. Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14. Blood. 113, 5848-5856 (2009).
- Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J Vis Exp. , (2008).
