Summary
본 논문은 특정 리간드에 leukocytes의 chemotactic 응답을 확인하고 라이브 셀 이미징 기술을 사용하여 세포 표면 수용체와 cytosolic 단백질 사이의 상호 작용을 식별하는 방법을 설명합니다.
Abstract
G - 단백질 결합 수용체 (GPCRs)는 일곱 transmembrane 단백질 제품군에 속하는 및 세포내 반응하는 세포 신호 전달을 중재. GPCRs 제어 등 chemotaxis와 같은 다양한 생물 학적 기능, 세포내 칼슘 릴리스 heterotrimeric G - 단백질 1-2 통해 리간드에 의존적인 방식으로 유전자 규정. 리간드 바인딩은 순환 아데노신 monophosphate (CAMP), 이노시톨의 삼인산 (IP3)와 diacyl 글리세롤 (DG)로 두번째 사자의 수준을 조절 heterotrimeric G - 단백질의 활성화로 이어지는 conformational 변화 일련의 유도. 수용체 리간드 바인딩의 활성화와 함께 수반하는 또 desensitization, 격리 및 / 또는 국제화를 통해 신호 수용체를 자제하는 이벤트의 시리즈를 시작합니다. GPCRs의 desensitization 과정은 G - 단백질 수용체 kinases (GRKs)과 β - arrestins 3 이후 결합하여 수용체의 인산화 통해 발생합니다. β - arrestins은 cytosolic 단백질이며 수용체 내면화 4-6을 촉진하여가 (대부분의 경우) phosphorylated 수용체에 결합, GPCR 활성화에 막으로 이동시키다.
와 LTB 4 수용체 2 (BLT2, 낮은 친화 수용체, Leukotriene B 4 (LTB 4) GPCRs, LTB 4 수용체 1 (고친 화성 수용체 BLT1)을 통해 arachidonic의 산성 경로 및 mediates의 행동에서 파생된 프로 염증성 지질 분자이다 ) 7-9. LTB 4 BLT1 경로는 천식, 관절염 및 죽상 경화증 10-17, 등 여러 가지 염증 질환에 중요한 것으로 표시되었습니다. 현재 신문은 LTB 4 유도된 백혈구 마이 그 레이션 및 BLT1의 상호 작용 β - arrestin과, 현미경 이미징 기술을 사용하여 18-19 살 세포 수용체의 translocation을 모니터하기 위해 개발된 방법을 설명합니다.
C57BL / 6 마우스에서 돌기 세포를 파생 골수는 격리 및 이전에 20-21을 설명한 교양되었습니다. 이러한 전지는 LTB 4 유도된 세포 마이 그 레이션을 보여주는 라이브 셀 이미징 방법으로 테스트되었습니다. 인간 BLT1는 녹색 형광 단백질 (β - 도착지 - GFP)로 태그가 C - 말단과 β - arrestin1에서 적색 형광 단백질 (BLT1 - RFP)를 지정하여 랫 Basophilic Leukomia (RBL - 2H3) 세포 라인에 plasmids 모두 transfected했습니다 18-19. 이러한 단백질 및 현지화 사이의 상호 작용 속도론는 라이브 세포 영상 현미경을 사용하여 모니터링할되었습니다. 현재 논문의 방법론은 라이브 세포에서 G 단백질 결합 수용체의 기능 반응을 조사하기 위해 미세 기술의 사용을 설명합니다. 현재 종이는 또한 수용체의 반응 속도론과 cytosolic 단백질 상호 작용을 결정하는 형광 강도를 정할 Metamorph 소프트웨어의 사용에 대해 설명합니다.
Protocol
방법론
현미경에 대한 설명
라이브 셀 이미징 실험 이클립스 TE300 니콘 인버티드 현미경에 부착된 TE - FM 에피 형광 시스템을 사용하여 수행된. 현미경 난방 무대를 갖춘. 멋진 스냅 HQ 디지털 B / W CCD (로퍼 과학) 카메라와 LAMDA 10-2 광학 필터 체인저 (서터 악기 회사) 현미경에 첨부되어 있습니다. 여기 및 발광 파장은 필터 바퀴 제어 및 Lamba 10-2 필터 휠 컨트롤러에 의해 제어되며, 셔터 인 스트 루먼트 (주) 노출 시간이 500 MS 충분히 살 세포에 RFP 또는 GFP를 볼 수 있어야합니다. 하드웨어 제어와 이미지의 취득 Metamorph 소프트웨어에 의해 제어됩니다. EGFP / DsRed 듀얼 이색성, 채도 기술, 현재 연구에 대한 필터의 선택은, 필터 S480/20x, S525/40m 및 S565/25x, GFP 및 RFP에 대한 S620/60m, 각각을 설정하고 있습니다. 이 필터 휠은 여섯 필터 세트 수용할 수 있습니다. 현미경는 조이 스틱과 함께 이전 Proscan 무대 컨트롤러와 연결되어 있습니다. 이러한 모든 하드웨어 첨부 파일 Metamorph 소프트웨어에 의해 제어하실 수 있습니다. 현미경도 micropipettes를 잡아 Micromanipulators와 함께 첨부되어 있습니다.
A. 측정 Leukotriene B 4 감독 돌기 세포 마이 그 레이션
위에서 설명한 현미경 설정을 사용하여, 우리는 실시간으로 리간드 감독 돌기 세포 이주를 다음의 방법을 개발했습니다. 두 micromanipulators (Narishige)은 현미경에 연결된 있습니다. LTB 4 기울기 방향으로 돌기 세포 (BMDCs) 파생 마우스 골수의 chemotaxis이 기록되었다. 여기서 우리는 마이크로 피펫에 리간드를로드하고 세포의 방향성 마이 그 레이션을 모니터링하기 위해 현미경의 온수 무대에 chemotaxis 실험을 설정, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 마이크로 pipettes를 준비하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 마이 그 레이션뿐만 아니라 라이브 세포의 chemotaxis의 억제제의 효과를 유도에서 독특한 chemoattractants의 효능을 테스트하기 위해 적용할 수 있습니다. 마우스 BMDCs 21 고립은 조브 22 등 여러 출판물에 설명되어 있습니다.
1. BMDCs의 준비
- 커버 슬립 아래 플루오로 요리하고, 그들이 앞서 실험의 16 시간을위한 성장 수에있는 플레이트는 BMDCs (10 일간 culturing 후).
- 1X PBS 3 ML 적어도 2 회 (접시에 1X PBS 3 ML를 추가하고 버퍼 출력을 aspirating하여)와 세포를 씻으십시오.
- 접시에 1XPBS 2 ML을 추가합니다. 세포는 이제 실험을 위해 준비가되어 있습니다. ° C 인큐베이터 사전 실험 37 세포 보관하십시오.
리간드 로드된 마이크로 피펫의 준비 :
- 수직 micropipette 풀러 (Narishige 국제 미국, 부동산)에, 유리 모세관 튜브 (6 "고양이 # 625500, AM 시스템, INC 유리 표준, 0.75 mm X 0.4 mm) 이후의 수정 프로그램입니다.
- 52 살에 온도를 유지 ° C와 유리가 날카로운 모서리 도움말을 형성 녹으 분열 시키려고 수 있습니다.
- 마이크로 피펫 홀더에 피펫을 수정.
- M - 900 (Narishige 국제 미국, Inc의) 현미경으로 관찰하여 마이크로 포지를 사용하여 마이크로 피펫의 거친 가장자리를 부드럽게.
- 각 실험에 대한 최소한 10-20 pipettes 준비. 참고 : micropipettes도 세계 정밀 계측기 (μ 팁, T1801TW1F)에서 구입하실 수 있습니다.
- 1 ML effendorf 튜브에 리간드의 원하는 농도 (현재 실험에서 100 nm의 LTB 4 500 μL)을 가지고 솔루션에 마이크로 피펫 팁을 유지하고 솔루션은 마이크로 피펫 (다시 작성)로 입력할 수 있습니다.
- 리간드와 주사기 (1 CC 투베르쿨린 주사기)에 1 ML을 가지고 천천히 처음부터 마이크로 피펫으로 마이크로 작성 바늘 (28G MF - 5, 세계 정밀 계측기)를 사용하여 리간드를 입력합니다.
- 리간드으로 가득 한 ML의 주사기에 연결된 (21 G 2분의 11) 바늘로 피펫 및 튜브에 피펫으로 단단히 맞는 튜브를 연결합니다.
- 이제 조심스럽게 마이크로 manipulators에 현미경 스테이지 및 수정하는 마이크로 피펫을 가득 리간드를 이동합니다.
- 확인 리간드 천천히 끝에서 공개하기 위해 주사기에서 약간의 압력을 적용합니다.
- 현미경을 도금 미숙 BMDCs을 지참하고 온수 플레이트 (37 ° C) 무대에서 그들을 유지.
- 플루오로 요리의 뚜껑을 제거합니다.
- 기름 침지 60X 목적 렌즈를 사용하여 세포를 집중.
- 신중하게, 세포의 근접에 '거친 수동 조작하는 사람 MN - 188NE'를 사용하여 피펫을로드 리간드를 가지고.
- '유압 파인 Micromanipulator MN - 188 NE'를 사용하여 피펫을 집중.
- 리간드가 그릇에 공개되어 있는지 확인하기 위해 주사기에서 약간의 압력을 적용합니다.
- 의 취득 이미지 수집 매개 변수를 설정 밝고 Metamorph 소프트웨어를 사용하여 2 시간을 위해 매 15 초에 (10 MS 노출) 제기했다.
- PR에 대한 매 30 분 모니터링 유지리간드 대한 마이 그 레이션 ogression.
- 세포 피펫 끝에 혼잡한 경우, 실험의 마이 그 레이션을 계속 접시에 끝의 위치를 변경합니다.
B. 측정 GPCR (BLT1)와 Cytosolic 단백질 (β - arrestin) 상호 작용, 라이브 세포 Translocation
1. 플라스미드 DNA 구조의 준비
DNA 플라스미드 구조의 세부 사항은 Jala 외. (2005) 18에 설명되어 있었다.
2. RBL - 2H3 세포로 인간 BLT1 - RFP 및 β - Arrestin - GFP의 Transfection
- 랫 Basophilic Leukomia (RBL - 2H3) 37 셀 (60-70% 합류) · 95 %의 공기의 humidified 분위기에서 C, 5 % CO 2를 유지 성장 미디어 monolayer 문화 (DMEM가 15% FBS, 2 보충으로 MM L - 글루타민, 100 U / ML 페니실린과 T75 flasks 100 μg / ML의 스트렙토 마이신).
- 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 6 ML (0.05 %의 트립신, 0.53 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))을 사용하여 37에서 5 분 잠복기에 의해 접시 / flasks에서 세포를 분리 ° 95 %의 공기의 humidified 분위기에서 C, 5 % CO 2. 부드럽게 세포의 분리의 정도를 모니터링하는 flasks를 흔들.
- 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 6 ML을 포함하는 플라스크로 성장 미디어 6 ML을 추가하고 여러 번 아래 pipetting과로 그들을 혼합하여 세포를 수집합니다. 15 ML 팰컨 튜브에 세포를 전송합니다.
- hemocytometer를 사용하여 세포를 카운트하고 transfection 미디어 200 μL 3 분 및 resuspend에 대한 480g RPM (DMEM, 20 % FBS, 50 MM HEPES) 15 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 4 X 10 6 세포를 가져가라. 당신이 3 transfections을 수행하려는 경우, 증가하는 휴대폰 번호와 transfection 매체의 볼륨에 의해 따라 셀 및 tranfection 미디어를 준비합니다.
- 최소 1.5 μg / μL의 농도에 transfected 수 plasmids를 준비합니다. 우리는 QIAGEN의 맥시 DNA 플라스미드 키트에게 사용하여 플라스미드 DNA를 준비합니다. 0.4 cm 전극 간격을 살균 전기의 cuvettes (바이오 - 래드 # 16552088)에 대한 개인이나 인간 BLT1 - RFP (25 μg)과 β - arrestin1 - GFP (15 μg)을 모두 플라스미드 DNAs 인코딩을 추가합니다.
- 위의 resuspended 세포 200 μL를 가지고 hBLT1 - RFP 또는 β - arrestin1 - GFP 또는 둘 모두가 함께 중 하나를 포함 cuvettes에 배치하고 1 ML 멸균 피펫 조심스럽게 그들을 섞는다.
- 10 분 상온에서 위의 cuvettes를 남겨주세요.
- 전압 250 V 및 용량 500 μF와 진 Pulser II의 세포를 Electroporate.
- electroporation 후 세포를 10 분 실온에서 머물게.
- 정기적인 성장 매체 1 ML를 타고 cuvettes에 electroporated 세포와 함께 섞는다.
- , 5 % CO를 정기적으로 성장 미디어 2 ML을 포함 35mm 조직 유리 바닥 문화 요리 (플루오 요리, 세계 정밀 계측기)에이 혼합 300 μL를 배포하고 37 1 시간에 대한 품어 ° C를 95 %의 공기의 humidified 분위기에서 2. 세포는 접시의 바닥을 준수하도록 허용합니다.
- 정기적인 성장 매체와 부화 1 H 후에 미디어를 교체하고, 37에서 성장 허용 ° 95 %의 공기의 humidified 분위기에서 C, 18-24 시간 5 % CO 2 배양기를.
3. 라이브 셀 이미징
이미지의 취득
- 18-24시 이후, 10 MM의 HEPES, 산도 7.55을 (플레이트 및 대기음 미디어에 직접 따뜻한 미디어 2 ML을 추가합니다. 반복 2 또는 3 회)가 들어있는 따뜻한 페놀 레드 무료 RPMI 2 ML있는 셀에 2 또는 3 번 씻는다. 10 MM의 HEPES를 포함하는 따뜻한 페놀 레드 무료 RPMI의 1.8 ML를 추가합니다.
- hBLT1 - RFP 및 온수 현미경 무대에서 β - arrestin1 - GFP (37 ° C)와 transfected RBL - 2H3 세포를 포함한 플레이스 30mm 유리 coverslip 바닥 문화 요리.
- 60 X 객관적 니콘 계획 APO 60X/1.4 수치 조리개 기름 침지 렌즈 (우리의 현미경 시스템에서 사용할 수있는)를 사용하여 600x 배율에서 셀 이미지를 수집합니다.
- 60 X의 객관 렌즈 하나 기름 방울을 넣고 일반 명시야와 세포 초점을 맞추고 접시의 바닥을 만져 빛을 전송.
- transfected 단백질의 형광, 형광 필터 (RFP 필터, 당신이 β - arrestin1을보고 싶으면, 수용체 또는 GFP를보고 싶은 경우) 명시야 (전송 빛)에서 스위치를 모니터링합니다.
- RFP 필터 및 이미지를 캡처를 사용하여 세포 표면에 hBLT1 - RFP을 표현하는 밝고 건강한 세포를 선택합니다.
- 그런 GFP 필터 전환 및 β - arrestin - GFP의 세포질로 표현되었는지 확인하고 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 의사 컬러 모두 이미지 캡처 시간이 형광을 통해 출혈이 RFP와 GFP 사이에 발생을 복용하지 않도록 라이브 셀 이미지를 타락한 전에.
- 휴대폰의 선택이 만들어되면, 소프트웨어를 사용하여 목적 (이 인스턴스에서 Metamorph 소프트웨어)에 따라 매개 변수를 설정합니다.
- 현재 시연에서는, 16 비트 이미지는 온과 함께 찾았습니다라스의 비닝의 1로 설정 60 X 객관적 니콘 계획 APO 60X/1.4 수치 조리개 기름 침지 렌즈와 결합된 X 1.
- Metamorph 소프트웨어에 의해 제어되는이 사용하는 필터 바퀴 30 초 시간 간격 (translocation / 상호 작용을 너무 빨리하는 경우, 그 중 하나가 시간 간격을 줄일 수)에 동시에 RFP 및 GFP의 fluorochromes에 대한 형광 이미지를 수집합니다.
- 카메라 노출 시간은 RFP 및 GFP 1000 밀리초로 설정하십시오. (RFP 및 GFP의 형광 강도에 따라 특정 노출 시간을 설정합니다.)
- 첫 공 시점 역할을 추가 리간드없이 1 분에 대한 이미지를 수집합니다.
- 1 분 후 접시 / 또는 셀 위치를 방해하지 않고 리간드의 200 μL를 (10 μm의 재고에서 1 μm의의 최종 농도)를 추가합니다.
- 형광 이미지는 파일 이름의 증가 순서로 리간드를 삽입한 후 60 분에 대한 수집 및 TIFF 이미지로 저장됩니다.
- 이러한 모든 파일은 소프트웨어를 사용하여 타임 스탬프 개별 / 결합 형광 이미지로 스택 파일로 만들 수 있습니다.
이미지의 프로세스와 단백질 및 현지화의 형광 부량
- RFP 및 GFP 형광 필터를 일반 미디어 (NO 세포)로 이미지를 수집하고 배경 이미지로 저장합니다. 위에서 얻은 실제 데이터 이미지에서 빼기 이러한 이미지를 사용합니다.
- RFP 및 GFP 이미지를 개별적으로 이미지의 스택을 준비합니다.
- RFP 및 GFP의 형광 강도를 (BLT1 및 β - arrestin의 translocation) 측정하는 다양한 영역을 (표면 VS cytosolic)를 선택 / 정의
- 시간의 함수로 금액 형광 강도를 플롯. 이 그래프는 주어진 분자의 translocation의 동력학에 대한 정보를 제공합니다.
대표 결과
A. 측정 Leukotriene B 4 감독 돌기 세포 마이 그 레이션
이 프로토콜에서 설명한 방법은 leukotriene B 4 (그림 1과 연결된 비디오 1) 21쪽으로 돌기 세포 이주를 결정하는 데 사용되었다. 우리는 살아 세포에서 특정 리간드로 세포의 chemotactic 용량을 결정하기 위해 유사한 방법론을 적용할 수 있습니다.
그림 1. 마우스 골수는 100 nm의 LTB 4 방향으로 돌기 세포 이주를 파생.
비디오 1. LTB 4 방향 BMDCs의 셀 마이 그 레이션 라이브. 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
B. 측정 GPCR (BLT1)와 Cytosolic 단백질 (β - arrestin) 상호 작용, 라이브 세포 Translocation
이 절차의 완료되면, 하나는 GPCR 신호 이벤트에 다음과 같은 정보를 얻을 수 있습니다.
- GPCR과 cytosolic 단백질과 핵의 현지화 (그림 2).
- 리간드 유도 cytosolic 단백질 (이 경우에는 β - arrestin) (그림 3)과 표면 GPCR (이 경우에는 BLT1)의 상호 작용.
- 막에 수용체 국제화 및 β - arrestin translocation의 속도론은 수용체 (그림 4) (Jala 외. 2005) 18과 함께 국제화 다음.
- 하나는 라이브 세포의 리간드에 의존 수용체 활성화 상태를 (비디오 2 첨부) 확인하고 수용체 활성화 (Jala 외. 2005) 18 개입 중요한 주제이나 프로세스를 확인할 수 있습니다.
그림 2. RBL - 2H3 세포에 BLT1 - RFP (A), β - arrestin - GFP (B), pNuc - CFP (C)의 표현. 패널 D.에 표시된 색상 결합된 이미지
그림 3. 수용체와 β - arrestin의 리간드 유도 translocation. 세포의 형광 강도의 라인 스캔이 표시됩니다.
그림 4. 1 μm의 LTB 4시 또한 수용체의 내면화 및 β - arrestin translocation의 속도론. 형광 강도는 막과 세포의 cytosolic 위치에서 시간의 함수로 측정되었다.
1 μm의 LTB 4 이외에 BLT1 - RFP 및 β - arrestin - GFP를 표현하는 세포의 비디오 2 라이브 영상이. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오
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Discussion
라이브 셀 이미징들은 실시간으로 발생과 같은 특정 단백질의 기능과 상호 작용을 설명하는 강력한 도구입니다. 이 논문에서 설명하는 방법은 명확하게 LTB 4 돌기 세포의 빠른 마이 그 레이션을 일으킬 수 보여줍니다. 이러한 방법은 다양한 세포 유형 LTB 4 기능의 측면뿐만 아니라 확장, 그들은 유사한 방법을 다른 chemokines의 다양한 적용 및 다른 백혈구 하위 집단에 대한 chemotactic 대리인으로서의 효능을 테스트 할 수 있습니다. 이 시스템의 형광 이미징 실시간으로 신호 이벤트를 모니터링하실 수 있습니다. 또한, 이러한 방법은 또한 적절한 flurochromes 태그 분자를 사용하여 형광 공명 에너지 전달 (걱정)에 따라 생체내에서 분자의 꽉 연결을 검사하기 위해 확장할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
연구는 보건 보조금 국립 연구소 AI - 52381, CA138623 및 켄터키 폐암 연구위원회와 제임스 그레이엄 브라운 암 센터에서 제도적 지원에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells. | ATCC | CRL-2256 | |
| Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| Phenol red free RPMI or DMEM | Invitrogen | 11835-030 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin (10000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300 | |
| HEPES (1M) | Invitrogen | 15630 | |
| 35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | |
| Gene Pulser II electroporater | Bio-Rad | ||
| TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300 | Nikon Instruments | ||
| Metamorph Software | Universal Imaging | ||
| Vertical Micro-pipette puller | Narishige International | ||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | ||
| Hadraulic Micromanipulator MO-188NE | Narishige International | ||
| Coarse Manual Manipulator, MN-188NE | Narishige International | ||
| cDNA constructs: | |||
| cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP) | Jala et al 2005 | ||
| cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study). | Jala et al 2005 |
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