Summary
Growing certaines variétés de lin dans les résultats du stress de nutriments dans la variation génomique au sein d'un sous-ensemble du génome et de la variation phénotypique. Une insertion complexes sur un site spécifique est associée à la croissance sous les divers régimes d'éléments nutritifs et à des changements dans l'expression des gènes dans ce site.
Abstract
Certaines variétés de lin de réagir au stress en nutriments, en modifiant leur génome et ces modifications peuvent être héritées à travers de nombreuses générations. Également associés à ces changements génomiques sont héréditaires phénotypique 1,2 variations. Le lin diverses Stormont Cirrus (Pl) lorsqu'il est cultivé dans trois différentes conditions nutritives peuvent soit rester inductible (dans les conditions de contrôle), ou devenir stable modifiées soit à la genotroph grande ou petite par la croissance en haute ou basse conditions nutritives respectivement. Les lignes résultant de la croissance initiale de chacun de ces conditions semblent mieux se développer lorsqu'il est cultivé dans les mêmes conditions dans les générations suivantes, notamment la ligne Pl pousse mieux dans le traitement de contrôle qui indique que la culture des plantes dans les nutriments haute et basse sont sous le stress. Une des modifications génomiques qui sont associées à l'induction de changements héréditaires est l'apparition d'un élément d'insertion (LIS-1) 3, 4, tandis que les plantes sont de plus en plus sous le stress nutritif. En ce qui concerne cet événement d'insertion, le lin diverses Stormont Cirrus (Pl) lorsqu'il est cultivé dans trois différentes conditions nutritives peuvent soit rester inchangé (dans les conditions de contrôle), ont l'insertion apparaissent dans toutes les plantes (sous nutriments faible) et ont transmis cette à la génération suivante, ou avoir de l'insertion (ou de parties de celui-ci) apparaissent mais ne pas être transmis à travers les générations (de nutriments sous haute) 4. La fréquence de l'apparition de cette insertion indique qu'il est sous sélection positive, qui est également conforme à la réponse de croissance dans les générations suivantes. Les feuilles ou les méristèmes récoltés à divers stades de croissance sont utilisés pour l'ADN et l'isolement d'ARN. L'ARN est utilisé pour identifier des variations dans l'expression associée à la croissance des environnements différents et / ou t-il la présence / absence de LIS-1. L'ADN isolé est utilisé pour identifier ces plantes dans lesquelles l'insertion s'est produite.
Protocol
1. La croissance du lin dans des conditions d'induction.
- 5 "pots sont remplis de terre et raffermie.
- Trois graines par pot sont plantés ¼ de pouce de profondeur et le sol raffermi au cours des graines.
- Les pots sont ensuite arrosées avec 100ml de solutions appropriées en nutriments
- Le non-induisant de contrôle (C) des conditions d'utilisation une force 1 / 10 ème Miracle-Gro chaque semaine. La condition élevée en éléments nutritifs (NPK traitement) avaient Miracle pleine force appliquée Cultivez hebdomadaire. Faible en nutriments - les plantes que l'eau du robinet avait appliqué tout au long de leur croissance. (Durrant 1971, Cullis, 1980).
- Les plantes sont cultivées sous lumière naturelle durant l'été. Pendant l'hiver, ils sont cultivés sous les lumières de sodium avec un 16 / 8 heures cycle lumière / obscurité.
- A intervalles hebdomadaires feuilles et les méristèmes sont prélevés.
- Le matériel végétal est rapide congelés dans l'azote liquide.
Résultats
Les trois génotypes différents croître à des taux relatifs en fonction des conditions (figure 1). Par conséquent, dans des conditions de contrôle de la ligne Pl pousse mieux avec L plus vigoureux que S (figure 1a). Sous nutriments faible (eau), S pousse mieux que ce soit L ou Pl (figure 1b). Sous élevée de nutriments (NPK) L pousse mieux que Pl qui ne pousse que légèrement mieux que S (figure 1c). Une comparaison entre chacune des lignes cultivées sous les trois traitements différents est montré dans la figure 1 D - F. Pl. pousse mieux dans des conditions de contrôle (figure 1d), la meilleure L sous nutriments élevé (figure 1e) et S de la même sous les deux nutriments élevés et des conditions de contrôle (Figure 1f).
Ces données montrent que les trois lignes peuvent être différenciés en fonction de leur croissance dans les trois environnements. Il est à noter que les Pl. pousse mieux dans les conditions de contrôle tandis que L pousse mieux dans les conditions NPK (sous lequel elle a été induite). S grandit peu près le même dans tous les trois conditions, qui est, il n'est pas en mesure de profiter de l'amélioration des conditions de nutriments, mais est mieux en mesure de croître sous conditions de très faible en éléments nutritifs.
Les paramètres de croissance qui sont pertinents pour la différenciation des plantes comprennent la hauteur de la plante (et associés à cette longueur internodale l', qui est la distance entre chaque feuille), la taille des feuilles et le degré de ramification. Pour Pl. dans des conditions de contrôle de l'usine est grand avec des branches et les feuilles sont vertes grande et sombre. Sous nutriments peu la plante est très court, la distance entre chaque feuille est également très court et les feuilles sont vertes petit et léger. Les feuilles à l'extrémité sont vert plus foncé que les plus bas de la tige. Sous haute nutriments de la plante ressemble beaucoup à celle des conditions de contrôle, sauf que les deux la tige principale et les pousses latérales sont plus courtes que dans les plantes témoins. Pour la grande genotroph les plantes sont très similaires à ceux de Pl, sauf que la croissance la plus vigoureuse en moins de nutriments élevés. Encore une fois sous les nutriments peu la plante est très court et a feuilles vert clair. Le genotroph S croît pareillement dans les trois environnements bien que les feuilles sont vert plus clair dans les nutriments faible. Cependant, dans les conditions pauvre en nutriments du genotroph S est beaucoup plus vigoureuse que ce soit de la PL ou des lignes L.
2. ARN et extractions d'ADN à partir de méristèmes de lin et les feuilles sont faites séparément. La Roche ARN total de préparation kit a été utilisé pour les extractions d'ARN et l'ADN de Qiagen DNeasy usine de préparation kit a été utilisé pour l'extraction d'ADN.
Extraction des ARN
- 3 méristèmes plus quelques feuilles environnantes sont déplacés de cryovial stockage en tube Eppendorf et placées dans l'azote liquide avant d'être prêt à broyer.
- Sable stérile est ajoutée au tube et le tissu est broyé en utilisant un micropestle jusqu'en fin.
- 400 lyse ul / tampon de liaison de Roche ARN total Prep Kit est ajoutée et le tissu est broyé encore jusqu'à ce qu'il n'y touffes sont visibles.
- L'échantillon est vortexé pendant 15 sec à l'aide de lyse puis centrifugée pendant 1 min à 13000 rpm pour recueillir du sable et des débris.
- Le surnageant est ajouté à tourner la colonne et le reste des instructions ARN Prep Kit sont suivies comme indiqué.
DNAse traitement
- 1 / 10 volume d'échantillon d'ARN de DNAse tampon 10X est ajouté.
- 30 unités de DNAse est ajouté et la réaction est incubée à 37 ° C pendant 30 min et 70 ° C pendant 5 min.
Reverse Transcription
- Applied Biosystems ARN pour kit d'ADNc est utilisé selon les directives, la réaction incubées à 37 ° C pendant 1 heure et 95 ° C pendant 5 minutes.
L'ADNc est ensuite utilisée dans la PCR ou pour qPCR
qPCR
qPCR été réalisée en utilisant une étape ABI Un système. Tous les essais ont été réalisés en triple sur chaque course. Le gène de l'actine a été utilisée comme un contrôle du nombre de copies quele gène de mieux ménager disponibles.
- La paire d'amorces appropriée a été ajouté à chaque tube dans 1 microlitre.
- L'ADNc a été dilué à la concentration appropriée et 9μl ajouté à chaque tube
- 10 ul de l'Alimentation 2x SYBR Green PCR MasterMix (ABI) et a été ajouté à chaque tube
- Le programme d'amplification du programme a été:
- 10 minutes à 95 ° C
- 40 cycles de 15sec à 95 ° C, 1 min à 60 ° C
Étape de dénaturation thermique afin de vérifier la spécificité d'amplification - Les niveaux d'expression relative ont été déterminées par la valeur de 2 (CTunknown - CTactin).
Préparation de l'ADN
- Tampon AP1 de Qiagen DNeasy DNA Plant Prep Kit est ajouté à 6 feuilles avec du sable stérile dans un tube de centrifugeuse. Le tissu est broyé avec micropestle jusqu'à ce qu'il n'y touffes sont visibles.
- Les instructions du kit sont suivies comme indiqué.
Résultats
L'amplification par PCR de l'ADN isolé à partir de feuilles à différentes positions le long de la tige montre que l'apparition de LIS-1 survient alors que les plantes poussent dans des conditions induisant (4). Les résultats qPCR montrent que la présence de LIS-1 (ou d'autres modifications génomiques associées à l'induction) affecte l'expression des gènes dans le voisinage immédiat de la LIS-1 (figure 2). Les six gènes montre la figure 2 sont tous exprimés différentiellement dans Pl et S avec quatre ayant une expression plus élevée en PL (sans LIS-1) et deux ayant une expression plus élevée dans S (qui ne sont LIS-1). Panel 1 et 2 sont les deux gènes proches du point d'insertion de la LIS-1. L'expression de ces gènes dans le s genotroph grande (qui a connu des changements induits, mais n'a pas LIS-1) et l'expression sous différentes conditions de croissance seront nécessaires pour déterminer une relation causale entre le LIS-1 et les changements d'expression.
Figure 1. Pl, L et S grandi sous trois régimes différents nutriments. Panneaux a - contrôle, b - nutriments bas et c - NPK. d - Pl., E - S, f - L. Panneaux d - f de gauche à droite: les nutriments bas, de contrôle et NPK. D - Pl, e - L, F - S.
D'expression génique Figure 2. Autour du point d'insertion de la LIS-1. Gene 1 (inhibiteur de croissance) est immédiatement 5 'du gène LIS1 et 2 (Kip liés cycline-dépendante Identifiant inhibiteur de la kinase 3 "de LIS-1. Les autres gènes sont tous le long de la même échafaud (~ 500ko) construit à partir du séquence complète du génome du lin. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une figure plus grande .
Figure 3. Amplifications par PCR d'ADN extrait de feuilles de plantes individuelles de Stormont Cirrus cultivées sous des conditions de faible en éléments nutritifs. Les produits de PCR ont été séparés sur un agarose à 2%-TBE gel. Le site uninserted est montré dans un Panel, les deux extrémités du site insérés sont indiqués dans les panneaux B et C. Des échantillons de feuilles de 1 à 6 ont été isolés à des intervalles hebdomadaires avec l'échantillon 1 étant la plus ancienne après le semis.
Discussion
Le lin semble avoir un génome fondamentalement instable. Un certain nombre de variétés commerciales de fibre de lin rapidement devenu non-uniforme lorsqu'il est cultivé pendant quelques générations. Les mêmes observations ne semblent pas vrai pour les variétés de lin huile. Par conséquent, il semble y avoir une association entre la sélection pour la qualité des fibres et de l'instabilité du génome. L'environnement induit des changements héréditaires dans le lin ont été initialement identifiés par l'enquête sur les observations agronomiques de la croissance de la récolte de la fibre. Ces observations reproductibles des variations spécifiques phénotypiques et génomiques soulève la question de savoir comment le stress environnemental peut influencer la suite de réarrangements génomiques qui peuvent survenir. L'apparition répétée de la LIS-1 en réponse à des environnements particuliers est conforme à cette mutation étant directement ou indirectement sélectionnée. La croissance des lignes induite par divers traitements indique également une amélioration des performances dans les conditions induisant pertinents. Les changements dans l'expression aussi associé à la présence de SIL-1 indique à nouveau que cette insertion affecter les performances des plantes. La vidéo de présentation offre un forum pour l'observation des changements phénotypiques des plantes d'une manière impossible à transmettre à travers des documents imprimés traditionnels.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety denoted Pl and the genotrophs L and S. | |||
| 5" pots | |||
| potting soil | |||
| Miracle-Gro | |||
| greenhouse | |||
| High pressure sodium lights | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mortar and pestles | |||
| Micropestles and microfuge tubes | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electrophoresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| StepOne qPCR module | |||
| Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit | |||
| Applied Biosystems RNA to cDNA kit | |||
| Roche total RNA prep kit |
References
- Durrant, A. The environmental induction of heritablel change in Linum. Heredity. 17, 27-61 (1962).
- Cullis, C. A. Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax. Heredity. 38, 129-154 (1977).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol. , 167-171 (2005).
- Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax. Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).
