Summary
ゲノムと表現型変異のサブセット内にゲノム変異の栄養ストレスの結果の下にある亜麻の品種を育てる。特定のサイトでの複雑な挿入は、様々な栄養素体制の下で成長したとこのサイトの周り遺伝子発現の変化と関連付けられています。
Abstract
いくつか亜麻の品種は、そのゲノムを変更することによって、栄養ストレスに応答し、これらの変更は、多くの世代にわたって継承することができます。また、これらのゲノムの変化に関連付けられていると表現型のバリエーションの1,2を遺伝している。つの異なる栄養条件下で栽培亜麻多様ストーモントシーラス（PL）のどちらか（対照条件下）誘導性のまま、または安定的にそれぞれの高または低栄養条件下での成長が大きいか小さいgenotrophのいずれかに変更になることができます。これらの各条件の下で初期成長に起因する線は、PLラインが両方ともハイとローの栄養素で植物栽培が下にあることを示す制御処理で最高の成長著しく、その後の世代で同じ条件下で増殖した場合より良い成長に見えるストレス。植物が栄養ストレス下で成長している間に遺伝性変化の誘導に関連付けられているゲノムの変化の一つは、挿入要素の外観（LIS - 1）3、4です。この挿入イベントに関しては、つの異なる栄養条件下で栽培亜麻多様ストーモントシーラス（PL）のどちらか、（制御条件の下で）変更されないまま挿入はすべての植物に表示される（低栄養素の下）と、これが送信されていることができます次の世代に、または挿入（またはその一部）を持って表示されますが、世代（高い栄養素下）4を介して送信することはできません。この挿入の出現頻度は、それはまた次の世代の成長の応答と一致している正の選択、下にあることを示しています。成長の様々な段階で収穫された葉や分裂は、DNAとRNAの分離に使用されます。 RNAは、様々な成長の環境および/またはt彼LIS - 1の存在/不在に関連付けられている式の中で変化を識別するために使用されます。単離されたDNAは、挿入が発生しているそれらの植物を識別するために使用されます。
Protocol
1。誘導条件下での亜麻の成長。
- 5"ポットは、土壌を充填し、確定されています。
- ポットごとに3つの種子が植えられている¼インチ深いと土は、種子を介して確認した。
- ポットは、適切な栄養溶液100mlのと水遣りされています
- 非誘導コントロール（C）の条件は、毎週1 / 10の強度ミラクル-グロを使用してください。高栄養状態（NPKの治療は）完全な強度のミラクルは毎週適用育てていた。低栄養 - 植物は彼らの成長全体に適用される水道水を持っていた。 （デュラン1971、カリス1980）。
- 植物は夏の間、自然光の下で栽培されています。冬の間、彼らは8分の16時間の明/暗サイクルでナトリウム灯の下で栽培されています。
- 週間間隔で葉や分裂組織が収集されます。
- 植物材料は、迅速に液体窒素中で凍結されています。
結果
3つの遺伝子型は、条件（図1）に応じて異なる相対的な速度で成長する。したがって、制御条件の下でのPLラインは、LはS（図1a）よりも活発であることで最高の成長。低栄養素（水）の下で、SはLまたはPL（図1b）のいずれかより良い成長。高栄養下で（NPK）、LはSよりわずかに良い成長（図1c）PLよりも優れて成長する。 F. - 3つの異なった治療法で育成した行のそれぞれの間の比較を図1のDに示されていますPLは高い栄養と制御条件（図1F）の両方で同様に高栄養（図1e）とSで最高の、Lを制御条件下で最高の成長（図1d）。
これらのデータは3行が3つの環境下での彼らの成長に基づいて区別できることを示している。注目すべきは、LはNPKの条件（それが誘導されたの下）の下で最高の成長ながら、PLは制御条件の下で最高の成長ということです。 Sが3つの条件すべてに同じ程度成長する、つまり、それは改善された栄養条件を活用することではありませんが、良い、非常に低栄養条件下で成長することが可能です。
植物の分化に関連する成長パラメータは、植物の高さ（とそれぞれの葉の間の距離ですこの節間長、関連付けられている）、葉の大きさや分岐の程度が含まれています。 plに関する制御条件の下で植物は枝と背が高いと葉が大きく、濃い緑色です。低栄養素の下で植物が非常に短い場合、各葉の間の距離も非常に短く、葉が小さく、薄い緑色です。先端の葉が茎ダウン低いものよりも暗い緑です。高い栄養素の下で植物は主茎や側枝の両方がコントロール植物に比べて短いことを除いて、制御条件の下でそれと非常によく似ています。大genotrophのための植物は高い栄養素の下で最も活発な成長点を除いてPLのものと非常によく似ています。再び低栄養素で植物は非常に短く、光の緑の葉を持っています。葉は低い栄養素の下に軽く緑色ですがS genotrophは、3種類の環境すべてで同じように成長する。しかし、低栄養状態でS genotrophはPLまたはLラインのどちらよりもはるかに活発です。
2。亜麻の分裂と葉からRNAとDNAの抽出を別々に行われます。ロシュトータルRNAプレップキットはRNA抽出のために使用され、キアゲンDNeasy植物DNAプレップキットは、DNA抽出に使用されていました。
RNA抽出
- 3分裂組織およびいくつかの周囲の葉は、エッペンドルフチューブにストレージクライオバイアルから移動し、地面になる準備ができるまで、液体窒素中に配置されます。
- 滅菌砂をチューブに添加され、組織は罰金までmicropestleを使用して粉砕される。
- ロシュトータルRNAプレップキットから400 ulの溶解/結合バッファーを添加していない塊が表示されていないまで、組織はさらにグランドです。
- サンプルは、砂やごみを収集するために13,000 rpmで1分間スピンして溶解を助けるとに15のために秒をボルテックスしています。
- 上清をカラムにスピンに追加され、指示されたとおりにRNAプレップキットの説明書の残りの部分が続いている。
DNase処理
- 10XのDNaseバッファーの1 / 10のRNAサンプルの量が追加されます。
- DNaseの30単位を添加し、反応を37℃でインキュベートされた℃で30分間、70℃で5分間のためのC。
逆転写
- cDNAをキットにアプライドバイオシステムズRNAが当たり方向、37度でインキュベート反応℃で1時間および95℃で5分間として使用されます。
cDNAは、PCRや定量PCRに使用されます
定量PCR
定量PCRはABIのステップOneシステムを用いて行った。すべてのアッセイは、実行ごとに三連で行った。アクチン遺伝子はコピー数の制御などに使用された利用可能な最善のハウスキーピング遺伝子。
- 適切なプライマー対は、1μlの各チューブに添加した。
- cDNAは、適切な濃度と9μlに希釈し、各チューブに添加
- 2倍のパワーSYBRグリーンPCRマスター（ABI）の10μlを、各管に添加した
- プログラムの増幅プログラムがあった。
- 95℃で10分° C
- 95℃15秒の40サイクル° C、60 ° Cで1分
増幅の特異性を確認するために熱変性のステップ - 相対的な発現レベルは2の値（ - CTactin CTunknown）により決定した。
DNA調製
- キアゲン社DNeasy植物DNAプレップキットからバッファAP1は、マイクロ遠心チューブに滅菌砂で6葉に追加されます。ない塊が表示されていないまで、組織はmicropestleで粉砕される。
- キットの指示は、指示どおりに続いている。
結果
幹に沿って様々な位置での葉から単離したDNAからのPCR増幅は植物が誘導条件（4）の下で成長している間にLIS - 1の外観が発生したことを示しています。定量PCRの結果は、LIS - 1（または誘導に関連する他のゲノムの変化）の存在が、LIS - 1のすぐ近く（図2）の遺伝子の発現に影響を及ぼすことを示している。図2に示す6つの遺伝子は、すべての差動4つ以上のPLの発現（LIS - 1を適用していない）とSのより高い発現を（LIS - 1を持っていない）有する二つを持って使用して、PLとSで表されます。パネル1と2は、LIS - 1の挿入ポイントに近い位置にある2つの遺伝子である。大genotrophでこれらの遺伝子の発現（これは誘導される変化があったがLIS - 1を持っていない）とは異なる成長条件での発現は、LIS - 1と発現の変化との間に因果関係を判断するために必要となる。
図1。PL、LとSは、3種類の栄養素体制の下で成長した。パネル - コントロール、B - 低栄養素およびc - NPK。 D - PL、E - S、F - D L.パネル - fを左から右へ：低栄養素、コントロールとNPK。 D - PL、電子 - L、F - S.
LIS - 1の挿入ポイントの周りの図2。遺伝子発現。遺伝子1（成長の阻害剤）LIS1にすぐに5'であり、LIS - 1の遺伝子2（キップ関連のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤のID 3"。他の遺伝子はすべてから構築された同一の足場（〜500KB）に沿っている亜麻のゲノム配列を完了してください。下さい大きな図をご覧いただくにはこちらをクリック 。
図3。低栄養条件下で栽培ストーモントシーラスの植物の個々の葉から抽出したDNAのPCR増幅。 PCR産物を2％アガロース- TBEゲル上で分離した。 uninsertedサイトがパネルに示されている、挿入部位の両端は、パネルBおよびCに示されています葉のサンプル1から6は、サンプル1は、播種後早いいると毎週の間隔で分離した。
Discussion
フラックスは、本質的に不安定なゲノムを持っているように見えます。数世代にわたり増殖させた場合の商用繊維亜麻の種の数は急速に不均一になる。同じ観察結果は、石油の亜麻の種のために真のまま表示されません。したがって、繊維の質とゲノム不安定性のための選択の間に関連があるように見える。亜麻の環境誘発遺伝性の変化は、もともと繊維作物の成長の農業観測の調査によって確認された。特定の表現型とゲノムの変化のこれらの再現性の観察結果は、環境ストレスが発生する可能性がゲノム再編成のスイートに影響を与えることができるかという疑問が生じる。特定の環境に応じて、LIS - 1の繰り返し出現は、この変異が直接または間接的に選択されていると一致している。様々な処理により誘導される行の成長はまた、関連する誘導条件下でのパフォーマンスの向上を示している。また、LIS - 1の存在に関連した発現の変化は、再びこの挿入は、プラントのパフォーマンスに影響を与えることを示しています。ビデオプレゼンテーションは、従来の印刷物を通じて伝えることが不可能な方法で植物の表現型の変化を観察するためのフォーラムを提供しています。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety denoted Pl and the genotrophs L and S. | |||
| 5" pots | |||
| potting soil | |||
| Miracle-Gro | |||
| greenhouse | |||
| High pressure sodium lights | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mortar and pestles | |||
| Micropestles and microfuge tubes | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electrophoresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| StepOne qPCR module | |||
| Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit | |||
| Applied Biosystems RNA to cDNA kit | |||
| Roche total RNA prep kit |
References
- Durrant, A. The environmental induction of heritablel change in Linum. Heredity. 17, 27-61 (1962).
- Cullis, C. A. Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax. Heredity. 38, 129-154 (1977).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol. , 167-171 (2005).
- Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax. Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).
