Summary
Рост некоторых сортов льна под питательных результаты стресс в геномных вариаций в подмножество генома и фенотипической изменчивости. Комплекс вставки на конкретном участке связано с ростом в различных питательных режимов и с изменениями в экспрессии генов, вокруг этого сайта.
Abstract
Некоторые сорта льна реагировать на питательных стресса путем изменения их генома, и эти изменения могут передаваться по наследству на протяжении многих поколений. Кроме того, связанные с этими геномной изменения наследственных фенотипические 1,2 вариаций. Разнообразие льна Стормонт Cirrus (Pl) при выращивании в трех различных питательных условий может либо оставаться индуцибельной (под контролем условиях), или стать стабильно изменение либо больших или малых genotroph ростом под высоким или низким содержанием питательных веществ условий соответственно. Линий в результате первоначального роста в рамках каждого из этих условий по всей видимости, лучше растут при выращивании в одинаковых условиях в последующих поколениях, в частности, линии Pl лучше всего растет под контролем лечения о том, что растения, произрастающие в рамках как высокие и низкие питательные вещества находятся под стресса. Один из геномных изменений, которые связаны с индукцией наследственных изменений является появление вставки элементов (ЛИС-1) 3, 4, а растения растут в питательной стресса. В связи с этим событием вставки, разнообразие льна Стормонт Cirrus (Pl) при выращивании в трех различных питательных условий может либо оставаться неизменным (под контролем условий), имеют вставки появляются во всех растениях (при низких питательных веществ) и это передается к следующему поколению, или вставки (или его части) появляются, но не передается из поколения в поколение (в соответствии с высокими питательными веществами) 4. Частота появления этой вставки указывает, что при положительном выборе, который также соотносится с ростом ответ в последующих поколениях. Листья или меристемы собраны на разных стадиях роста используются для ДНК и РНК изоляции. РНК используется для идентификации изменения выражение, связанное с различными средами роста и / или те или наличие / отсутствие ЛИС-1. Выделенная ДНК используется для идентификации этих растений, в которой вставки не произошло.
Protocol
1. Рост льна под вызывающих условиях.
- 5 "горшки заполнены почвой и окреп.
- Три семян на горшок высаживают ¼ дюйма и почвы подтвердили более семян.
- Горшки затем поливают с 100 мл соответствующего питательных растворов
- , Не вызывающие контроля (С) условия использования 1 / 10 силы Miracle-Gro каждую неделю. Высокой питательной условие (NPK лечения) имели полную силу Чудо Grow применяется в неделю. Низкий питательной - растения было только водопроводная вода применяется на протяжении всей их роста. (Даррант 1971 году Cullis 1980).
- Растения выращивают при естественном освещении, в течение лета. Зимой они выращиваются под натриевые фонари с 16 / 8 час свет / темно-цикла.
- С интервалом в неделю листья и меристем собираются.
- Растительного материала быстро замораживали в жидком азоте.
Результаты
Три генотипа расти на различных относительных скоростей в зависимости от условий (рис. 1). Поэтому под контроль условий линии Pl лучше всего растет с L быть более энергичным, чем S (рис. 1а). В условиях низкой питательные вещества (воды), S растет лучше, чем любой L или Р (рис. 1b). При высокой питательных веществ (NPK) L растет лучше, чем Pl которых только растет несколько лучше, чем S (рис. 1в). Сравнение между каждой из линий, выращенных в трех различных процедур показано на рисунке 1 г - f. Pl лучше всего растет под контроль условий (рис. 1, г), L лучших условиях высокой питательной (рис. 1e) и S аналогичным образом под обоими высокими питательными и контроля условий (рис. 1е).
Эти данные показывают, что три строчки могут быть дифференцированы в зависимости от их роста в трех средах. Стоит отметить, что Pl лучше всего растет под контроль условия в то время как L лучше всего растет в условиях NPK (под которой он был индуцированной). S растет примерно в то же во всех трех условий, то есть она не в состоянии воспользоваться преимуществами улучшенной питательной условиях, но лучше способны расти при очень низких питательных условиях.
Параметры роста, которые имеют отношение к дифференциации растения включают высота растения (и связанных с этим междоузлия длиной, то есть расстояние между каждым слоем), размер листа и степенью ветвления. Для Pl под контролем условиях завода высотой с филиалами и листья большие и темно-зеленый. В условиях низкой питательные вещества растение очень короткий, расстояние между каждым листом также очень короткая и листья мелкие и светло-зеленые. Листьев на кончике являются темно-зеленый, чем те, внизу стебля. При высокой питательные вещества растение выглядит очень похоже на условиях под контролем исключением того, что как главный стебель и боковые побеги короче, чем у контрольных растений. Для больших genotroph растения очень похожи на тех Pl исключением того, что наиболее бурный рост в условиях высоких питательных веществ. Снова под низкие питательные вещества растение очень короткая и имеет светло-зеленые листья. S genotroph растет так же во всех трех средах, хотя листья светло-зеленого под низкие питательные вещества. Однако в условиях низкой питательной S genotroph намного более энергичным, чем любой из Pl или L линии.
2. РНК и ДНК выписки из меристем льна и листья делаются отдельно. Рош общей РНК приготовительные комплект был использован для экстракции РНК и Qiagen DNeasy завод ДНК приготовительные комплект был использован для извлечения ДНК.
Добыча РНК
- 3 меристем плюс некоторые окружающие листья перемещаются со склада криопробирку в трубку Eppendorf и помещают в жидкий азот пока не готова к земле.
- Стерильные песок добавляется в трубке и ткани местности с помощью micropestle пока нормально.
- 400 ул лизиса / буфера для связывания с Рош общей РНК приготовительные комплект добавлены и ткани еще больше земли, пока не видны скопления.
- Пробы перемешивали в течение 15 секунд, чтобы помочь лизис, а затем нити в течение 1 мин при 13000 оборотов в минуту для сбора песка и любой мусор.
- Супернатант добавляется спин колонки и остальной РНК приготовительные инструкции комплект следуют по назначению.
ДНКазы лечения
- 1 / 10 образцов РНК объема 10X буфера ДНКазы добавляется.
- 30 единиц ДНКазы добавляется и реакции инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин и 70 ° С в течение 5 мин.
Обратной транскрипции
- Applied Biosystems РНК кДНК комплекта используется как в направлениях, реакция инкубировали при 37 ° С в течение 1 часа и 95 ° С в течение 5 минут.
КДНК, которая затем используется в ПЦР или КПЦР
КПЦР
КПЦР проводили с использованием Шаг ABI Одна система. Все анализы были проведены в трех экземплярах, на каждом счете. Гена актина использовали в качестве контроля количества копий, какнаилучших имеющихся генов домашнего хозяйства.
- Соответствующие пары праймеров был добавлен в каждой пробирке в 1 мкл.
- КДНК разбавляют до нужной концентрации и 9μl добавляли в каждую пробирку
- 10 мкл Силы 2x SYBR Green ПЦР Mastermix (ABI) и был добавлен в каждую пробирку
- Программа Программа усиления было:
- 10 минут при 95 ° C
- 40 циклов 15 сек при 95 ° С, 1 мин при 60 ° C
Тепловая денатурация шаг для проверки усиления специфичности - Относительные уровни экспрессии определяется значение 2 (CTunknown - CTactin).
Препарата ДНК
- Буфер AP1 от Qiagen DNeasy завод ДНК приготовительные комплект добавлены до 6 листьев с стерильным песком в микроцентрифуге трубки. Ткань землю micropestle пока нет скопления видны.
- Комплект инструкций следуют по назначению.
Результаты
ПЦР-амплификации с ДНК, выделенной из листьев на различных позициях вдоль ствола показывает, что появление ЛИС-1 происходит в то время как растения растут под вызывающие условия (4). КПЦР результаты показывают, что наличие ЛИС-1 (или другие изменения генома связано с индукцией) влияет на экспрессию генов в непосредственной близости от ЛИС-1 (рис. 2). Шесть генов показано на рисунке 2 все-разному экспрессируются в Р и S с четырьмя имеющие высшее выражение в PL (без ЛИС-1) и две, имеющие высшее выражение в S (которая имеет ЛИС-1). Секция 1 и 2 двух генов ближе всего к точке вставки из ЛИС-1. Экспрессия этих генов с в большой genotroph (которая была изменений, вызванных, но не имеет ЛИС-1) и выражение в различных условиях роста будут необходимы, чтобы определить какой-либо причинно-следственной связи между библиотечно-1 и выражения.
Рисунок 1. Pl, L и S, выращенных в трех различных питательных режимов. Панели - контроль, б - низкие питательные вещества и с - NPK. г - Pl, э - S, F - Л. панели D - F слева направо: низкие питательные вещества, контроля и NPK. D - Pl, э - L, F - S.
Рисунок 2. Экспрессия генов вокруг точки вставки ЛИС-1. Генная 1 (ингибитора роста) сразу 5 'к LIs1 и ген 2 (Кип связанных циклинзависимых идентификатор ингибитор киназы 3 "ЛИС-1. Других генов, все по той же леса (~ 500кб) построены из полный геном льна последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы видеть большую фигуру .
Рисунок 3. ПЦР-амплификации ДНК, извлеченных из отдельных листьев растений Стормонт Cirrus, выращенных в условиях низкой питательной. ПЦР-продукты были разделены на 2% агарозном-TBE геля. Uninserted сайте показана в панели, два конца вставлена сайте показаны на панели В и С. Лист образцов 1 - 6 были изолированы с интервалом в неделю с образцом 1 будучи ранним после посева.
Discussion
Лен-видимому, нестабильны генома. Ряд коммерческих сортов льна-волокна быстро стал неоднородным при выращивании в течение нескольких поколений. Же наблюдения, похоже, не справедливы для сортов льна масличного. Поэтому, как представляется, связь между выбором для качественного волокна и нестабильности генома. Вызванной экологическими наследственные изменения в лен изначально были определены в ходе исследования агрономических наблюдений рост волокна урожая. Эти повторяющиеся наблюдения конкретных фенотипических и геномных вариаций возникает вопрос о том, как экологический стресс может влиять на набор геномных перестроек, которые могут возникнуть. Повторяется появление ЛИС-1 в ответ на конкретные среды соответствует эта мутация быть прямо или косвенно выбран. Рост линии, вызванную различными лечения также указывает на повышенную производительность при соответствующих условиях вызывать. Изменения в экспрессии также связано с наличием ЛИС-1 еще раз показывает, что эта вставка влияют на производительность предприятия. Видео-презентация представляет собой форум для наблюдения завод фенотипические изменения таким образом, невозможно передать с помощью традиционных печатных материалов.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety denoted Pl and the genotrophs L and S. | |||
| 5" pots | |||
| potting soil | |||
| Miracle-Gro | |||
| greenhouse | |||
| High pressure sodium lights | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mortar and pestles | |||
| Micropestles and microfuge tubes | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electrophoresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| StepOne qPCR module | |||
| Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit | |||
| Applied Biosystems RNA to cDNA kit | |||
| Roche total RNA prep kit |
References
- Durrant, A. The environmental induction of heritablel change in Linum. Heredity. 17, 27-61 (1962).
- Cullis, C. A. Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax. Heredity. 38, 129-154 (1977).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol. , 167-171 (2005).
- Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax. Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).
