Summary
Växande några linsorter i näringsämne stressen resulterar i genetisk variation inom en delmängd av genomet och fenotypisk variation. En komplex insättning på en viss plats är förknippad med tillväxt under olika näringsämnen regimer och med förändringar i genuttryck runt denna webbplats.
Abstract
Vissa linsorter svara på näringsämnen stressen genom att ändra deras genom och dessa ändringar kan ärvas genom många generationer. Också förknippade med dessa genetiska förändringar är ärftliga fenotypiska varianter 1,2. Linet olika Stormont Cirrus (Pl) när den odlas under tre olika näringsförhållanden kan endera kvarstå inducerbara (under kontroll förhållanden), eller bli stabilt ändrats till antingen stora eller små genotroph av tillväxt under hög eller låg näringsförhållan respektive. Linjerna till följd av den inledande tillväxten under varje av dessa tillstånd tycks växa bättre när den odlas på samma villkor i kommande generationer, framför allt Pl linjen växer bäst under kontroll behandling tyder på att växterna växer under både höga och låga näringsämnen är under stress. En av de genetiska förändringar som är förknippade med induktion av ärftliga förändringar är uppkomsten av en insättning element (LIS-1) 3, 4, medan plantorna växer under näringsämne stress. Med hänsyn till detta införandet händelse, lin olika Stormont Cirrus (Pl) när den odlas under tre olika näringsförhållanden kan antingen vara oförändrad (under kontroll förhållanden), har införandet förekommer i alla växter (under lågt näringsämnen) och har den här överförda till nästa generation, eller har införandet (eller delar av den) verkar dock inte överföras genom generationerna (under högt näringsämnen) 4. Frekvensen av uppkomsten av denna insättning visar att det är under positiv selektion, vilket också är i linje med tillväxten svar i kommande generationer. Blad eller meristems skördas vid olika stadier av tillväxt används för DNA och RNA isolering. RNA används för att identifiera variation i uttryck i samband med olika tillväxt-miljöer och / eller t han närvaro / frånvaro av LIS-1. De isolerade DNA används för att identifiera de anläggningar där införandet har skett.
Protocol
1. Tillväxten av lin i förmå förhållanden.
- 5 "krukor är fyllda med jord och fastare.
- Tre frön per kruka är planterade ¼ tum djupt och jorden bekräftade över fröna.
- Krukorna sedan vattnas med 100 ml av lämplig näringslösningar
- Den icke-inducerande kontroll (c) villkor använda en 1 / 10: e styrka Miracle-Gro varje vecka. Den höga näringsämnen skick (NPK-behandling) hade full styrka Miracle Grow används varje vecka. Låg näringsämnen - växter hade bara kranvatten tillämpas inom hela deras tillväxt. (Durrant 1971, Cullis 1980).
- Plantorna odlas under naturligt ljus under sommaren. Under vintern de odlas i natrium lampor med en 16 / 8 timmars ljus / mörker-cykel.
- Med en veckas mellanrum blad och meristems samlas in.
- Växtmaterialet är snabb fryst i flytande kväve.
Resultat
De tre genotyper växa vid olika relativa priser beroende på förhållanden (Figur 1). Därför under kontroll förhållanden Pl linje växer bäst med L är mer kraftfull än S (Figur 1a). Under låga näringsämnen (vatten), växer är bättre än både L och Pl (Figur 1b). Under hög näringsämnen (NPK) L växer bättre än Pl som bara växer något bättre än S (figur 1c). En jämförelse mellan de olika linjerna som odlas under de tre olika behandlingarna visas i figur 1 d - f Pl växer bäst under kontroll förhållanden (figur 1d), L bästa under hög näringsämnen (Figur 1e) och S lika under både högt näringsinnehåll och villkor kontroll (Figur 1f).
Dessa data visar att de tre linjerna kan differentieras baserat på deras tillväxt under de tre miljöerna. Att notera är att Pl växer bäst under kontroll förhållanden medan L växer bäst under NPK-villkor (enligt vilka det inducerade). S växer ungefär densamma i alla tre villkor, det vill säga den inte kan dra nytta av förbättrade näringsförhållanden men är bättre på att växa under mycket lågt näringsinnehåll förhållanden.
Tillväxten parametrar som är relevanta för differentiering av växterna omfatta anläggningens höjd (och i samband med detta internoden längden, det är avståndet mellan varje blad), bladet storlek och graden av förgrening. För Pl under kontroll förhållanden växten är hög med grenar och bladen är stora och mörkgröna. Under låga näringsämnen växten är mycket kort, är avståndet mellan varje blad också mycket kort och bladen är små och ljusgröna. Bladen på spetsen är mörkare gröna än de längre ner på stammen. Under högt näringsämnen växten ser mycket liknar den under kontroll förhållanden förutom att både huvud-stammen och skotten sidan är kortare än i kontrollgruppen växter. För den stora genotroph växterna ser mycket liknar Pl förutom att den mest kraftfulla tillväxt under hög näringsämnen. Återigen under låga näringsämnen växten är mycket kort och har ljusgröna blad. S genotroph växer lika i alla tre miljöer trots att bladen är ljusare gröna under den låga näringsämnen. Men i den låga näringsförhållanden S genotroph är mycket mer kraftfull än någon av Pl eller L linjer.
2. RNA och DNA extraktioner av lin meristems och blad görs separat. Den Roche totala RNA-prep kit användes för RNA-extraktion och Qiagen DNeasy växt DNA prep kit har använts för DNA-extraktioner.
RNA-extraktion
- 3 meristems plus några omgivande löv flyttas från lager cryovial till Eppendorf-rör och placeras i flytande kväve tills den ska malas.
- Steril sand läggs till rör och vävnad marken med hjälp av en micropestle till böter.
- 400 ul lys / bindningsbuffert från Roche totala RNA-prep kit är till och vävnad är ytterligare marken tills inga klumpar syns.
- Provet är vortexed i 15 sek för att underlätta lys och sedan snurrade i 1 min vid 13 tusen varv för att samla sand och eventuellt skräp.
- Supernatanten läggs att snurra kolumnen och resten av RNA-prep kit anvisningar följs enligt anvisningarna.
DNAse behandling
- 1 / 10 RNA provvolym 10X DNAse buffert tillsätts.
- 30 enheter av DNAse tillsätts och reaktion är inkuberas vid 37 ° C i 30 min och 70 ° C i 5 min.
Omvänd transkription
- Applied Biosystems RNA till cDNA sats används enligt anvisningarna, reaktion inkuberas vid 37 ° C i 1 timme och 95 ° C i 5 minuter.
Den cDNA används sedan i PCR eller realtids-PCR
qPCR
qPCR utfördes med hjälp av ett ABI Steg ett system. Alla analyser utfördes i tre exemplar på varje körning. Den aktin gen användes som en kopia nummer kontrollden bästa tillgängliga hushållning genen.
- Lämplig grundfärg paret inkom i varje rör i 1μl.
- Den cDNA späddes till rätt koncentration och 9μl tillsätts varje rör
- 10μl av 2x Ström SYBR Grön PCR mastermix (ABI) och lades till varje rör
- Programmet förstärkning programmet:
- 10 minuter vid 95 ° C
- 40 cykler av 15sec vid 95 ° C, 1 min vid 60 ° C
Termisk denaturering steg för att kontrollera förstärkningen specificitet - Den relativa uttrycket nivåerna bestäms av värdet av 2 (CTunknown - CTactin).
DNA-preparation
- Buffert AP1 från Qiagen DNeasy växt DNA prep kit läggs till 6 blad med steril sand i ett mikrofugrör. Vävnaden är marken micropestle tills inga klumpar syns.
- Satsen anvisningar följs enligt anvisningarna.
Resultat
PCR-amplifiering av DNA isolerat från bladen i olika positioner längs stjälken visar att uppkomsten av LIS-1 inträffar medan plantorna växer i förmå förhållanden (4). Den qPCR Resultaten visar att förekomsten av LIS-1 (eller andra genomiska förändringar i samband med framkallande) påverkar uttrycket av gener i omedelbar närhet av LIS-1 (Figur 2). De sex gener som visas i figur 2 är alla differentiellt uttryckta i PL och S med fyra som har högre uttryck i PL (utan LIS-1) och två som har högre uttryck i S (som har LIS-1). Panel 1 och 2 är de två generna närmast insättningspunkten i LIS-1. Uttrycket av dessa gener finns i den stora genotroph (som har haft inducerade förändringar men har inte LIS-1) och uttryck under olika odlingsbetingelser kommer att behövas för att fastställa eventuella orsakssamband mellan LIS-1 och de förändringar som uttryck.
Figur 1. Pl, L och S vuxit under tre olika näringsämnen regimer. Paneler en - kontroll, b - låg näringsämnen och c - NPK. d - Pl, e - S, F - L. Paneler d - f från vänster till höger: låg näringsämnen, kontroll och NPK. D - Pl, e - L, F - S.
Figur 2. Gene expression runt den punkt i införandet av LIS-1. Gene 1 (hämmare av tillväxt) omedelbart 5 "att LIs1 och genen 2 (Kip-relaterade cyklin-beroende kinas hämmare id 3" av LIS-1. Andra gener är alla i samma schavotten (~ 500KB) byggs från kompletta lin arvsmassa. Vänligen klicka här för att se en större bild .
Figur 3. PCR-förstärkningar av DNA extraherat från enskilda blad av växter av Stormont Cirrus odlas under lågt näringsinnehåll förhållanden. PCR-produkterna separeras på en 2% agaros-TBE gel. Den uninserted webbplats visas i panelen en, är de två ändarna av infogas plats som visas i paneler b och c. Leaf prover från 1 till 6 var isolerade med en veckas mellanrum med prov 1 är den tidigast efter sådd.
Discussion
Lin verkar ha en i sig instabil arvsmassa. Ett antal kommersiella sorter spånadslin snabbt bli icke-enhetlig när den odlas i ett par generationer. Samma observationer verkar inte vara fallet för de sorter oljelin. Därför tycks det finnas ett samband mellan valet för fiber kvalitet och arvsmassan instabilitet. Den miljömässigt inducerade ärftliga förändringar i lin ursprungligen identifieras genom undersökningen av agronomiska observationer av tillväxten av fibern grödan. Dessa repeterbara observationer av specifika fenotypiska och genetiska variationer väcker frågan om hur miljöbelastning kan påverka svit av genomiska omdisponeringar som kan uppstå. De upprepade utseende LIS-1 som svar på särskilda miljöer är förenligt med denna mutation är direkt eller indirekt vald. Tillväxten av de linjer som orsakas av olika behandlingar visar också en förbättrad prestanda inom ramen för de relevanta förmå villkoren. De förändringar i uttryck också associerade med förekomst av LIS-1 igen indikerar att denna insättning påverkar anläggningens prestanda. Den videopresentation är ett forum för att observera anläggningen fenotypiska förändringar på ett sätt omöjligt att förmedla genom traditionell tryckt material.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety denoted Pl and the genotrophs L and S. | |||
| 5" pots | |||
| potting soil | |||
| Miracle-Gro | |||
| greenhouse | |||
| High pressure sodium lights | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mortar and pestles | |||
| Micropestles and microfuge tubes | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electrophoresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| StepOne qPCR module | |||
| Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit | |||
| Applied Biosystems RNA to cDNA kit | |||
| Roche total RNA prep kit |
References
- Durrant, A. The environmental induction of heritablel change in Linum. Heredity. 17, 27-61 (1962).
- Cullis, C. A. Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax. Heredity. 38, 129-154 (1977).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol. , 167-171 (2005).
- Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax. Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).
