Summary

分离和<em在体外激活线虫精子

Published: January 31, 2011
doi:

Summary

一个来自男性的精子细胞的分离和激活的协议<em> C。线虫</em>这里描述。切割后结束精子的男性版本。蛋白酶此外,精子可以被激活。

Abstract

男性和雌雄同体自然就找到了两种线虫线虫性形式。变形虫精子产生的男性和雌雄同体。在配子发生的早期阶段,雌雄同体的生殖细胞分化成精子数量有限 – 约300 – ,并存储在一个小的“袋”之称的精囊。后来,雌雄同体不断产生卵母细胞 1。相比之下,男性产生专其整个成年的精子。男性产生这么多的精子,它在一个典型的成虫 2细胞总数的50%帐户。因此,隔离来自男性的精子是较雌雄同体容易。

只有一小部分男性是自然产生自发的非分离的X 染色体 3 。隧道与男性或更方便,引入的突变引起他(男性的高发病率)表型的雌雄同体的一些战略,通过它可以丰富男性人口3。

男性可以很容易地区别于雌雄同体通过观察尾部形态4。指出,雌雄同体的尾巴,而雄性的尾巴是交配结构的圆形。

切割尾部释放广大男性生殖道内储存的精子。夹层使用27表针的立体显微镜下进行。由于精子是不是身体与任何其他细胞相连,液压排出内部的内容包括男性身体精子 2 。

男性有直接解剖上的“精子中等”的小降。精子细胞是敏感的pH值的改变。因此,HEPES,一种化合物具有良好的缓冲能力是精子媒体使用。葡萄糖和其他盐类存在于精子媒体帮助维持渗透压,保持精子的完整性。

被称为减数分裂后的精子细胞分化成精子的精子或精子激活。震撼5,6尼尔森先前表明,圆形精子细胞能够被诱导分化成精子,通过添加各种活性化合物,包括链霉蛋白酶大肠杆菌在这里, 我们证明体外精子的C 线虫精子使用链霉蛋白酶E。

成功的精子是生育的先决条件,因此,在精子缺陷的突变体是无菌的。迄今几个突变体已被证明特别是在有缺陷的精子形成过程7。异常时,发现在体外激活新型SPE(有缺陷的精子)的突变体,将有助于我们发现参与此事件的其他球员。

Protocol

1)男性人口的富集根据实验的需要,大量的男性可以得到采用以下策略之一: 人口众多的野生型男性可OP50种子NGM板中心的一个小草坪上穿过5野生型男性和1雌雄同体。大约50%的后代子孙将野生型的男性。 他5(e1490)或他- 8(e1489)雌雄同体抛出大量的男性他和他的8男性肥沃的精子的形态和功能没有明显的缺陷。因此, 他或他的男?…

Discussion

除了分析SPE突变体,该协议有其他重要的应用,如精子形态分析与衰老。使用此协议的精子细胞和精子分离出可用于在其他下游实验,如野生型和突变体的精子8,9,幻灯片10, 生理测量9,11,甚至人工授精12精子活力的免疫。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢,黛安C.塞缪尔沃德奶昔和格雷戈里纳尔逊这种技术的先驱。我们感谢帕Kadandale和布赖恩Geldziler视频显示激活精子,有益的讨论Singson实验室成员;株和美国国立卫生研究院的总部大楼为我们支持通过授予(R01HD054681)。

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Tuberculin syringe   Becton Dickinson 309623 Syringe: 1 ml, needle:
27G X ½ in
Pap pen   Zymed 00-8888  
VWR VistaVision
HistoBond
Microscope Slides
  VWR International 16004-406 Dimension:
75X25X1mm
Cover glass   VWR International 48366045  
Protease   Sigma P-6911  

References

  1. Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
  2. Lhernault, S. W., Roberts, T. M. . Methods in Cell Biology. , 273-301 (1995).
  3. Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
  4. Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2008).
  5. Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
  6. Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
  7. L’Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
  8. Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
  9. Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
  10. Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
  11. Machaca, K., DeFelice, L. J., L’Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
  12. LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 689-692 (1994).

Play Video

Cite This Article
Singaravelu, G., Chatterjee, I., Marcello, M. R., Singson, A. Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm. J. Vis. Exp. (47), e2336, doi:10.3791/2336 (2011).

View Video