פרוטוקול עבור בידוד והפעלת spermatids מן הזכר<em> ג elegans</em> מתוארת כאן. חיתוך הקצה האחורי של spermatids משחרר זכר. Spermatids יכול להיות מופעל על ידי תוספת של פרוטאז.
Abstract
זכרים הרמפרודיטים הם שתי צורות המינית נמצא באופן טבעי נמטודות C. elegans. זרע amoeboid מיוצרים על ידי שני גברים הרמפרודיטים. בשלב מוקדם יותר של gametogenesis, בתאי הנבט של הרמפרודיטים להתמיין מספר מוגבל של הזרע – בערך 300 – ו מאוחסנים "תיק" קטן שנקרא spermatheca. מאוחר יותר, הרמפרודיטים הרף לייצר ביציות1. לעומת זאת, הזכרים מייצרים זרע רק לאורך הבגרות שלהם. הזכרים מייצרים זרע כל כך הרבה חשבונות עבור 50%> של תאים הכולל 2 מבוגרים אופיינית תולעת. לכן, בידוד זרע מהזכרים קל יותר מזה של הרמפרודיטים.
רק אחוז קטן של גברים נוצרות באופן טבעי, בשל הפער הלא ספונטני של כרומוזום X 3. מעבר הרמפרודיטים עם זכרים או בצורה נוחה יותר, את ההקדמה של מוטציות כדי להצמיח אותו (שכיחות גבוהה של זכרים) פנוטיפ כמה אסטרטגיות דרכו ניתן להעשיר את אוכלוסיית הגברים 3.
זכרים ניתן להבחין בקלות על ידי התבוננות 4 מורפולוגיה הזנב הרמפרודיטים. הזנב של הרמפרודיט הוא הצביע, ואילו זנבו של הזכר הוא מעוגל עם מבנים ההזדווגות.
חיתוך הזנב משחרר מספר עצום של spermatids מאוחסן בתוך מערכת הרבייה של הגבר. Dissection מבוצע תחת מיקרוסקופ סטריאופוני באמצעות מחטים מד 27. מאז spermatids אינם מחוברים פיזית עם כל שאר התאים, הלחץ ההידראולי מגרשת תוכן פנימי של הגוף הגברי, כולל spermatids 2.
הזכרים גזור ישירות על ירידה קטנה של "בינוני זרע". Spermatids רגישים שינוי ב-pH. לפיכך, HEPES, מתחם עם קיבולת חציצה טוב משמש בתקשורת הזרע. גלוקוז ומלחים אחרים מציגים בתקשורת זרע לסייע בשמירה על הלחץ האוסמוטי כדי לשמור על שלמות של הזרע.
פוסט meiotic בידול של spermatids לתוך זרע נקרא spermiogenesis או הפעלה הזרע. מנענע 5, ונלסון 6 בעבר הראו כי spermatids עגול יכול להיגרם להתמיין זרע על ידי הוספת מרכיבים שונים, כולל הפעלת Pronase E. כאן אנו מדגימים במבחנה spermiogenesis של C. elegans spermatids באמצעות Pronase E.
Spermiogenesis מוצלח הוא מראש הנדרשים לצורך פוריות ומכאן מוטנטים פגום spermiogenesis הם עקרים. מספר מוטציות עד כה הוכחו פגום במיוחד בתהליך spermiogenesis 7. חריגות שנמצאו במהלך בהפעלת במבחנה של הרומן SPE (spermatogenesis פגום) מוטנטים יעזור לנו לגלות שחקנים נוספים שהשתתפו באירוע.
Protocol
1) העשרה של האוכלוסייה הגברית בהתאם לצורך הניסוי, מספר גדול של זכרים ניתן להשיג על ידי העסקת אחת האסטרטגיות הבאות: אוכלוסייה גדולה של גברים סוג בר ניתן להשיג על ידי המעב?…
Discussion
בנוסף לניתוח מוטנטים SPE, פרוטוקול זה יש יישומים חשובים אחרים, כגון ניתוח מורפולוגיה הזרע עם ההזדקנות. Spermatids ו זרע בודד בפרוטוקול זה יכול לשמש בניסויים במורד אחרים כגון, immunostaining מסוג בר זרע מוטנטי 8, 9, תנועתיות הזרע על 10 שקופיות, מדידות פיזיולוגיות 9, 11,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים סמואל וורד, דיאן ג שייקים גרגורי נלסון עבור חלוצי הטכניקה הזו. אנו מודים Pavan Kadandale ובריאן Geldziler עבור קטעי וידאו המציג זרע מופעל, חברי המעבדה Singson לדיונים מועיל; CGC עבור זנים ו-NIH על תמיכתם בנו באמצעות מענק (R01HD054681).
Singaravelu, G., Chatterjee, I., Marcello, M. R., Singson, A. Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm. J. Vis. Exp. (47), e2336, doi:10.3791/2336 (2011).