İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm
Summary
Erkeğin spermatid yalıtma ve etkinleştirmek için bir protokol<em> C. elegans</em> Burada açıklanmıştır. Kesme erkek bültenleri spermatid posterior ucunda. Spermatid proteaz ilavesi ile aktive olabilir.
Abstract
Erkek ve çift cinsiyetli nematod C. elegans iki doğal olarak bulunan cinsel formları vardır. Amoeboid sperm, hem erkek ve hem de çift cinsiyetli tarafından üretilmektedir. Yaklaşık 300 – gametogenezis önceki aşamasında, çift cinsiyetli, germ hücreleri sperm sınırlı sayıda içine farklılaştırmak ve sperm kesesi olarak adlandırılan küçük bir 'çanta' saklanır. Daha sonra, sürekli oosit 1 çift cinsiyetli. Buna karşılık, erkekler onların yetişkinlik boyunca sadece sperm üretir. Erkekler, tipik bir yetişkin solucan 2 toplam hücrelerinin>% 50 hesapları bu kadar sperm üretir . Bu nedenle, erkekler sperm izole çift cinsiyetli, daha kolaydır.
Erkeklerde sadece küçük bir kısmını doğal X kromozomu 3 spontan olmayan disjunction nedeniyle oluşturulur. Daha rahat erkek veya mutasyonlar, O'na yol vermek için giriş (Erkekler Yüksek İnsidans) fenotip ile çift cinsiyetli Geçişi bir erkek nüfusun 3 zenginleştirmek hangi stratejilerin bazılarıdır.
Erkekler kuyruk morfolojisi 4 gözlemleyerek hermafroditlerde kolaylıkla ayırt edilebilir. Erkek kuyruk çiftleşme yapıları ile yuvarlak ise Hermafrodit kuyruğu, sivri.
Kesme kuyruk, erkek üreme sistemi içinde saklanan spermatid çok sayıda serbest bırakır. Diseksiyon bir stereo mikroskop altında 27 gauge iğne kullanılarak yapılır. Spermatid fiziksel herhangi bir diğer hücrelere bağlı olmadığından, hidrolik basınç spermatid 2 de dahil olmak üzere erkek vücudunun iç içeriği , ihraç etti.
Erkekler doğrudan 'Sperm Orta' küçük bir damla disseke edilir. Spermatid pH değişikliğe duyarlıdır. Bu nedenle, iyi bir tamponlama kapasitesine sahip bir bileşik HEPES sperm medyada kullanılmaktadır. Glikoz ve sperm medya bulunan diğer tuzlar osmotik basıncı korumak sperm bütünlüğünü korumak için yardımcı olur.
Spermatozoa içine spermatid Post-mayotik farklılaşma spermiogenesis veya sperm aktivasyon denir. 5 Titreşim ve Nelson 6 yuvarlak spermatid Burada C. in vitro spermiogenesis göstermek Pronase E. dahil olmak üzere çeşitli aktive bileşikleri ekleyerek sperm ayırt etmek için daha önce uyarılan olabileceğini gösterdi Pronase E. kullanarak elegans spermatid
Başarılı spermiogenesis doğurganlık için ön koşuldur spermiogenesis kusurlu mutantlar ve dolayısıyla sterildir. Şimdiye kadar birkaç mutantlar özellikle spermiogenesis süreci 7 kusurlu olduğu görülmüştür. Anormallik roman Bedelli (Spermatogenez kusurlu) in vitro aktivasyonu mutantlar bize, bu etkinliğe katılan ek oyuncular keşfetmenize yardımcı olacak sırasında bulundu .
Protocol
Discussion
Bedelli mutantlar analiz ek olarak, bu protokol, yaşlanma ile sperm morfolojisi analiz gibi diğer önemli uygulamaları vardır. Spermatid ve spermatozoa izole bu protokolü kullanarak, yabani tip ve mutant sperm 8, 9, 10, fizyolojik ölçümler slaytlar 9, 11, hatta suni tohumlama 12 sperm motilite immün gibi diğer alt deneylerinde kullanılabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz teşekkür ederiz Samuel Ward, Diane C. Bu teknikte öncü Titreşim ve Gregory Nelson. Biz aktif sperm gösteren videolar için teşekkür Pavan Kadandale ve Brian Geldziler yararlı tartışmalar için Singson laboratuar üyeleri; CGC suşları ve NIH hibe (R01HD054681) aracılığı ile bize destek için.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tuberculin syringe | Becton Dickinson | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
|
| Pap pen | Zymed | 00-8888 | ||
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides |
VWR International | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
|
| Cover glass | VWR International | 48366045 | ||
| Protease | Sigma | P-6911 |
References
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. . Methods in Cell Biology. , 273-301 (1995).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2008).
- Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
- Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
- L’Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
- Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
- Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
- Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
- Machaca, K., DeFelice, L. J., L’Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
- LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 689-692 (1994).
