Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

doi: 10.3791/2336 Published: January 31, 2011

Summary

פרוטוקול עבור בידוד והפעלת spermatids מן הזכר

Abstract

זכרים הרמפרודיטים הם שתי צורות המינית נמצא באופן טבעי נמטודות C. elegans. זרע amoeboid מיוצרים על ידי שני גברים הרמפרודיטים. בשלב מוקדם יותר של gametogenesis, בתאי הנבט של הרמפרודיטים להתמיין מספר מוגבל של הזרע - בערך 300 - ו מאוחסנים "תיק" קטן שנקרא spermatheca. מאוחר יותר, הרמפרודיטים הרף לייצר ביציות 1. לעומת זאת, הזכרים מייצרים זרע רק לאורך הבגרות שלהם. הזכרים מייצרים זרע כל כך הרבה חשבונות עבור 50%> של תאים הכולל 2 מבוגרים אופיינית תולעת. לכן, בידוד זרע מהזכרים קל יותר מזה של הרמפרודיטים.

רק אחוז קטן של גברים נוצרות באופן טבעי, בשל הפער הלא ספונטני של כרומוזום X 3. מעבר הרמפרודיטים עם זכרים או בצורה נוחה יותר, את ההקדמה של מוטציות כדי להצמיח אותו (שכיחות גבוהה של זכרים) פנוטיפ כמה אסטרטגיות דרכו ניתן להעשיר את אוכלוסיית הגברים 3.

זכרים ניתן להבחין בקלות על ידי התבוננות 4 מורפולוגיה הזנב הרמפרודיטים. הזנב של הרמפרודיט הוא הצביע, ואילו זנבו של הזכר הוא מעוגל עם מבנים ההזדווגות.

חיתוך הזנב משחרר מספר עצום של spermatids מאוחסן בתוך מערכת הרבייה של הגבר. Dissection מבוצע תחת מיקרוסקופ סטריאופוני באמצעות מחטים מד 27. מאז spermatids אינם מחוברים פיזית עם כל שאר התאים, הלחץ ההידראולי מגרשת תוכן פנימי של הגוף הגברי, כולל spermatids 2.

הזכרים גזור ישירות על ירידה קטנה של "בינוני זרע". Spermatids רגישים שינוי ב-pH. לפיכך, HEPES, מתחם עם קיבולת חציצה טוב משמש בתקשורת הזרע. גלוקוז ומלחים אחרים מציגים בתקשורת זרע לסייע בשמירה על הלחץ האוסמוטי כדי לשמור על שלמות של הזרע.

פוסט meiotic בידול של spermatids לתוך זרע נקרא spermiogenesis או הפעלה הזרע. מנענע 5, ונלסון 6 בעבר הראו כי spermatids עגול יכול להיגרם להתמיין זרע על ידי הוספת מרכיבים שונים, כולל הפעלת Pronase E. כאן אנו מדגימים במבחנה spermiogenesis של C. elegans spermatids באמצעות Pronase E.

Spermiogenesis מוצלח הוא מראש הנדרשים לצורך פוריות ומכאן מוטנטים פגום spermiogenesis הם עקרים. מספר מוטציות עד כה הוכחו פגום במיוחד בתהליך spermiogenesis 7. חריגות שנמצאו במהלך בהפעלת במבחנה של הרומן SPE (spermatogenesis פגום) מוטנטים יעזור לנו לגלות שחקנים נוספים שהשתתפו באירוע.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1) העשרה של האוכלוסייה הגברית

  1. בהתאם לצורך הניסוי, מספר גדול של זכרים ניתן להשיג על ידי העסקת אחת האסטרטגיות הבאות:
    1. אוכלוסייה גדולה של גברים סוג בר ניתן להשיג על ידי המעבר 5 זכרים סוג בר 1 אנדרוגינוס על הדשא קטן של OP50 seeded במרכז צלחת NGM. בערך 50% של בני הדור שלאחר יהיה סוג הזכרים בטבע.
    2. אותו-5 (e1490) או אותו-8 (e1489) הרמפרודיטים לזרוק מספר רב של גברים. אותו-5 ו-8 לו זכרים פוריים ואין פגם ברור במורפולוגיה הזרע ותפקודו. לכן, אותו-5-8 או אותו הזכרים יכולים לשמש במקום הזכרים סוג בר ניסויים רבים.

2) זיהוי ובידוד של זכרים

  1. בדוק את המורפולוגיה הזנב של תולעים, תולעת הזנב של הזכר הוא מעוגל.
  2. פיק L4 הזכרים הבמה ולהעבירם seeded צלחת NGM עם E. coli OP50 ולתת להם לגדול במשך יום או יומיים. הזכרים מתנזר גידול בהעדר הרמפרודיטים למנוע אובדן של זרע ולכן מספר גדול של spermatids יהיה זמין במהלך הליך ניסיוני.
  3. ביום לנתיחה, להעביר את הזכרים מתנזר על צלחת NGM ללא חיידקים ולתת להם לזחול בשביל כמה דקות. פעולה זו מסייעת להסיר שכבה קטנה של E. החיידק דבק על פני השטח של תולעים. לחלופין, נפח פיפטה קטנה של M9 חיץ (6 גרם Na 2 HPO 4, 3G KH 2 PO 4, 5 גרם NaCl, 0.25g MgSO 4 0.7 H 2 O לליטר) בכוס לצפות הזכרים להעביר לתוך המאגר.

3) Dissection של הזכרים והן הפעלה חוץ גופית

  1. קח שקופיות הזכוכית לסמן עיגול קטן באמצעות עט פאפ. פיפטה 30-50 μl של זרע בינוני 1X (HEPES 50mm, 25mm KCl, NaCl 45mm, 1mm MgSO 4, 5 מ"מ CaCl 2, 10mm דקסטרוז, pH 7.8) בתוך מעגל. המעגל הידרופובי עוזר לשמר את הזרע בינוני בתוך הגבול שלה.
  2. העברת הזכרים 50-10 על המדיום הזרע.
  3. הצגת שקופיות תחת מיקרוסקופ, להחזיק שני מזרקים מחוברים עם 27 מחטים מד על שתי הידיים.
  4. השתמש באחת המחט "להחזיק" את התולעת ולהשתמש מחט אחרים לחתוך את הקצה האחורי של הזכרים לשחרר spermatids.
  5. חיתוך התולעת בדרך כלל מגרש מספר עצום של spermatids מיידי. Spermatids נראים כמו דקה "גרגרי" תחת מיקרוסקופ הסטריאו. עם זאת, לפעמים חלק או רוב spermatids עשוי להישמר בתוך הפגר. במקרה כזה, בעדינות "גרירת" פגר על שקופיות הזכוכית עשויה להקל על שחרורו של spermatids מן השלד.
  6. כדי להפעיל את spermatids, לנתח את התולעים בינוני זרע המכיל E 1X Pronase (20μg/ml) ולתת להם לשבת במשך 5 דקות.
  7. אל תאפשר השקופיות להיות יבש בכל נקודת זמן הניסוי. הוסף בינוני זרע 1X יותר במידת הצורך.

4) ויזואליזציה של spermtids ו זרע

  1. בעדינות למקום coverslip על פני השטח של מדגם גזור.
  2. מצא את תחום spermatids בהגדלה נמוכה (10X)
  3. הפרטים הקטנים של spermatids או זרע ניתן לראות על ידי מעבר ההגדלה גבוה יותר - בדרך כלל טבילה שמן 100x.

5) נציג תוצאות

דוגמה תמונה של DIC spermatids מבודד זכר C. elegans מוצג באיור 1. Spermatids הם כדוריים בצורת גרעינים בולטים. הופעל בשנת זרע במבחנה מוצגות באיור 2.

איור 1
באיור 1. DIC תמונה של ג elegans spermatids.

איור 2
איור 2. DIC תמונה של במבחנה מופעל C. elegans זרע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בנוסף לניתוח מוטנטים SPE, פרוטוקול זה יש יישומים חשובים אחרים, כגון ניתוח מורפולוגיה הזרע עם ההזדקנות. Spermatids ו זרע בודד בפרוטוקול זה יכול לשמש בניסויים במורד אחרים כגון, immunostaining מסוג בר זרע מוטנטי 8, 9, תנועתיות הזרע על 10 שקופיות, מדידות פיזיולוגיות 9, 11, או אפילו הזרעה מלאכותית 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

אנו מודים סמואל וורד, דיאן ג שייקים גרגורי נלסון עבור חלוצי הטכניקה הזו. אנו מודים Pavan Kadandale ובריאן Geldziler עבור קטעי וידאו המציג זרע מופעל, חברי המעבדה Singson לדיונים מועיל; CGC עבור זנים ו-NIH על תמיכתם בנו באמצעות מענק (R01HD054681).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tuberculin syringe BD Biosciences 309623 Syringe: 1 ml, needle:
27G X ½ in
Pap pen Zymed Laboratories, Inc. 00-8888
VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides VWR international 16004-406 Dimension:
75X25X1mm
Cover glass VWR international 48366045
Protease Sigma-Aldrich P-6911

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
  2. Lhernault, S. W., Roberts, T. M. Methods in Cell Biology. Vol. 48 273-301 (1995).
  3. Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
  4. Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2008).
  5. Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
  6. Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
  7. L'Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
  8. Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
  9. Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
  10. Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
  11. Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
  12. LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 689-692 (1994).
בידוד<em> במבחנה</em> הפעלת<em> Caenorhabditis elegans</em> זרע
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singaravelu, G., Chatterjee, I., Marcello, M. R., Singson, A. Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm. J. Vis. Exp. (47), e2336, doi:10.3791/2336 (2011).More

Singaravelu, G., Chatterjee, I., Marcello, M. R., Singson, A. Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm. J. Vis. Exp. (47), e2336, doi:10.3791/2336 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter