Summary
多能干细胞悬浮液中生长分化成胚状体（EBS）。在这里，我们展示了如何获得高品质的EB冰冻切片，用于研究胚胎发育的细胞和分子方面，同时保留其作为集合体的组织。
Abstract
胚胎干细胞（ES细胞）产生的多能干细胞的囊胚阶段的早期哺乳动物胚胎的内细胞团。在ES细胞分化的一个关键阶段，是形成胚状体（EBS）集合2， 3。 EB的形成是基于自发聚集在非贴壁板培养的ES细胞。三维的EB概括许多方面的早期哺乳动物胚胎发育和分化成三个胚层：外胚层，中胚层和内胚层4。
免疫荧光和原位杂交技术被广泛用于目标在一个组织的第5，6，7细胞中的蛋白质和mRNA的检测技术。在这里，我们提出一个简单的技术来产生高质量的冰冻切片胚体。这种方法依赖于EB嵌入在华侨城的空间方向的cryosection技术。由此产生的部分可以受到各种各样的分析程序，以表征含有的某些蛋白质，RNA或DNA的细胞种群。在这个意义上说，EB的冰冻切片的准备（10微米），是必不可少的工具（如Hematoxilin和曙红，DAPI）的组织学染色分析，免疫荧光法（如OCT4，巢）或原位杂交。这种技术还可以帮助了解胚胎发育方面与关于维护三EBS的三维球形结构。
Protocol
1。固定和冷冻保存
丝裂霉素C灭活，并辅以20％的血清替代淘汰赛（KSR）和8ng /毫升的成纤维细胞生长因子（FGF - 2）的DMEM/F12维持到小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的多能干细胞培养。为了诱导EB形成H9的细胞被转移到非贴壁的菜肴和7天，保持在15％KSR 8为辅的DMEM/F12培养。
（！）注意：这种技术可以用于任何胚胎和诱导多能干细胞衍生分化。
- 用移液器从培养皿中收集的EBS。
- 胚转移到15 mL锥形管，等到材料汇到试管底部。
- 取出介质，并修复了4％多聚甲醛（PFA）的PBS溶液，在室温下30分钟EBS。
（！）注： 对于原位杂交抗原恢复应该做的，以避免因使用煤灰6,7与抗体的交联反应。 - 删除煤灰的解决方案，并用PBS冲洗5分钟。
- EBS应放置在串行PBS缓冲的蔗糖溶液的稀释（10，20和30％的序列，）在25-28 ° C，每个解决方案必须更换，每30分钟。该材料可被放养在30％的蔗糖溶液4 ° C，直到与华侨城的嵌入步骤。
2。组织包埋，指导和冻结
- 小心收集管胚。放电尽可能多的蔗糖溶液。
注意（！）：之前收集的EBS的蔗糖溶液的尖端内部墙是很重要的湿的。此过程可避免的EB附加给小费。 - 放置在模胚，并用滤纸除去剩余的蔗糖溶液。
注意（！）：重要的是不要填写与EBS的模具，以避免重叠。 - 与华侨城填充模具缓慢，照顾不重新暂停分化。之后，放置在模具中心的所有EB和用吸管去除气泡。
- 轻度搅拌15分钟。
- 环绕粉碎的干冰冻结的样品模具。华侨城应该被完全冻结。此时块可以储存在-70 ° C，至少一年。
3。 Cryosectioning技术
- 删除冻结块从-70 ° C和低温恒温器的地方，以前在温度冷却-18和-21 ° C。
注意（！）：在此范围外的气温可能会导致像部分的麻烦，卷曲，熔化或开裂。 - 脱离模具的OCT块，放入恒温器支持它加入更多的华侨城。
- 重要的是东方块正确并对齐平行刀片的边缘。
注意（！）：由于胚小于其他组织样本，这一步是非常重要的材料，以尽量减少损失。 - 华侨城块应切片表面，直到表面平面。薄片（10μM）必须采取的组织标本，并装上玻璃，幻灯片以前涂上与200 mg / mL的聚L赖氨酸（10％μL 幻灯片 ） 9,10。
（！）注：为了避免torned节注意的任何损害，在刀片。 - 所有的部分，应在室温下1小时，空气干燥，然后使用或存放在-70 ° C，直到使用。
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Discussion
这里介绍的方法提供了一个易于遵循协议来获取煤灰固定薄低温恒温器的部分有用的胚体免疫荧光法和原位杂交检测。造成冰冻切片允许人类胚胎干细胞分化的细胞和分子方面的研究，同时保持它们的结构和组织作为聚合。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是保护行使宪法权利Fundação支持Pesquisa做州里约热内卢（FAPERJ），Conselho国立发展Científico发送Tecnológico圣保罗大学和研究所的全国Ciência发送Tecnologia（INCTC）。布鲁纳保尔森和艾琳M.费尔南德斯的EB图像，我们非常感谢。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura Finetek | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
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