Larval zebrafish representar o sistema primeiro modelo vertebrados para permitir a gravação simultânea patch clamp um músculo do neurônio motor e alvo espinhal esquelético. Este vídeo demonstra os métodos microscópicos utilizados para identificar uma CaP segmentar do neurônio motor e células do músculo-alvo, bem como as metodologias para a gravação de cada tipo de célula.
Larval zebrafish representar o sistema primeiro modelo vertebrados para permitir a gravação simultânea patch clamp um músculo do neurônio motor e alvo da coluna vertebral. Esta é uma conseqüência direta da acessibilidade para os dois tipos de células ea capacidade de distinguir visualmente o CaP única segmentar motor-neurônio com base na morfologia e localização. Este vídeo demonstra os métodos microscópicos utilizados para identificar uma CaP motor-neurônio e células musculares alvo, bem como as metodologias para a gravação de cada tipo de célula. A identificação do tipo CaP motor-neurônio é confirmado por um ou outro recheio corante ou pelas características biofísicas, como forma de onda do potencial de ação e resistência de entrada da célula. Motor-neurônio gravações rotineiramente durar uma hora permitindo gravações a longo prazo a partir de várias células musculares diferentes alvo. Controle sobre o padrão de disparo dos neurônios motor permite medições da freqüência de dependência da transmissão sináptica na junção neuromuscular. Devido a um tamanho grande quântica eo baixo nível de ruído fornecida pelo clamp toda célula de tensão, todos os eventos unitária podem ser resolvidos no músculo. Este recurso permite estudo de propriedades básicas sináptica, como propriedades de liberação, a reciclagem de vesícula, bem como a depressão sináptica e facilitação. As vantagens oferecidas por este in vivo preparação eclipse anterior modelo de sistemas neuromuscular onde estudou os neurônios motores são geralmente estimuladas por eletrodos extracelulares e os músculos são grandes demais para grampo toda célula patch. A preparação do peixe-zebra é passível de análise eletrofisiológica combinando com uma grande variedade de abordagens, incluindo linhagens transgênicas, knockdown morfolino, intervenção farmacológica e in vivo de imagens. Estas abordagens, juntamente com o crescente número de modelos de doenças neuromusculares fornecidos por linhas mutantes de peixe-zebra, abrir a porta para uma nova compreensão do ser humano doenças neuromusculares.
Temos vindo a utilizar zebrafish gravações emparelhados (Wen e Brehm, 2005), principalmente para estudar os processos de liberação de vesículas e reciclagem durante a estimulação de alta freqüência. Este processo é interrompido em mutantes motilidade em que a transmissão sináptica normal é comprometida devido a mutações pontuais nos principais componentes sináptica. Por exemplo, mutações que perturbam agregados receptor pós-sináptico (Ono et al., 2001, 2002, 2004) e de síntese do transmissor pré-sináptico (Wang et al., 2008) resultar em não-coordenada de natação. Gravações emparelhado fornecer as informações que possam identificar a origem do defeito funcional, que liga comportamento, genética e fisiologia. Agora deve ser possível dissecar ainda mais os processos subjacentes a transmissão sináptica por meio da expressão transitória do CaP motor neurônios utilizando promotores criteriosa. Desta forma dominante genes mutados negativa ou pode ser especificamente expressas nestes neurônios e suas conseqüências comportamentais e eletrofisiológicos determinado. A vantagem adicional oferecida pela configuração da célula permite que toda a diálise da soma CaP com agentes que podem potencialmente alterar a reciclagem das vesículas, como toxinas clostridial e buffers de cálcio. Devido à curta distância entre o soma eo músculo, a difusão deve ocorrer bem dentro do prazo de gravações. O potencial desta preparação só começou a ser aproveitado. A transparência dos peixes neste local idade e superficial de sinapses também facilita a utilização de instrumentos ópticos (Fetcho e O'Malley, 1997; Fetcho e Higashijima, 2004). Temos sido muito bem sucedida na medição de endo e exocitose nos peixes que vivem usando corantes FM e indicadores genéticos, tais como Synaptophluorin (Li et al., 2003). Além disso, as toxinas conjugado fluorescente pode ser usado para rotular proteínas sinápticas para geração de imagens de peixes vivos (Ibanez-Tallon et al., 2004). Dada a simplicidade desta preparação, é uma grande promessa para futuros estudos.
The authors have nothing to disclose.
Financiado pelo NIH (NS-18205).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Pneumatic transducer tester | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | ||
0.002 x 3 inch tungsten rod | A-M Systems Inc | 715000 | ||
Sylgard 184 Elastomer | Dow Corning Corp. | The thickness of application will affect the DIC optics |