从噬菌体抗体库的肽调节间质细胞的基因表达和使可能在Unicortical骨缺损的成骨

Summary

噬菌体展示库，用于识别目标的骨肽序列。其目的是调查这些肽的间质细胞分化的影响，以确定其对骨再生的效果。

Abstract

两种新型合成肽加速骨形成和可交付使用的胶原蛋白基质。这项研究的目的是探讨在unicortical缺损模型骨修复的影响。治疗间质细胞产生碱性磷酸酶活性的增加，表明细胞结节的形成，并提高Runx2的，osterix，骨涎蛋白和骨钙素基因的表达。胶原蛋白海绵浸泡肽促进骨缺损的修复，而控制效果较差。这项研究的结果表明，对成骨肽在体外治疗的间质细胞分化，并且，在体内交付使用胶原海绵肽促进unicortical缺陷的修复。

Protocol

1。Biopanning 体内分离出噬菌体目标的长骨

噬菌体DNA测序，并与相应的序列合成肽。肽合成甘氨酸 - 甘氨酸 - 甘氨酸，丝氨酸，赖氨酸连接器（链接器​​所需要的夫妇，帮助跟踪/追踪肽的荧光生色）。

1. 10周龄BALB / c小鼠被麻醉，暴露心脏。
2. 博士- 12噬菌体展示肽库试剂盒（New England Biolabs公司，富康，MA）是用于在体内biopanning，10 × 1010 PFU，并注入心脏。
3. 大约5分钟后，鼠标安乐死。暴露和解剖股骨，股骨的两端被切断，和骨髓被删除。
4. 左股骨内，外，用PBS冲洗10次，股骨添加到ER2537细菌（简称非洗脱噬菌体，请跳到步骤6）。
5. 右股骨交锁髓内运河的21号针头的2％干脱脂牛奶注射器冲洗10次，以去除非约束噬菌体。束缚噬菌体洗脱与盐酸甘氨酸缓冲液pH值2.2，瓦解1M三髓内运河，ER2537细菌，培养，扩增噬菌体（简称为洗脱）为4.5小时。
6. 细菌被拆除离心沉淀为10 ° C，而噬菌体沉淀在4 ° C过夜PEG / NaCl溶液中的另外4分钟。噬菌体是离心收集悬浮和沉淀两次，另外的1 / 6量的PEG /氯化钠。最后沉淀悬浮在TBS的0.02％叠氮化钠。
7. 洗脱和非洗脱噬菌体扩增洗脱液分别注入不同的小鼠，上述隔离和噬菌体。只有从注射非洗脱噬菌体，股骨直接放入细菌（见上述第4步）鼠标左股骨。洗脱噬菌体鼠标的分离只能从右侧股骨和盐酸甘氨酸缓冲液（见上面的步骤5）前公布增加细菌的噬菌体。
8. 在体内 biopanning程序重复使用- 98底漆（噬菌体展示套件提供）的DNA测序前的三倍。
9. 汇集噬菌体在细菌培养中扩增，纯化，定量分析，然后分别注入了第四鼠标。序列是重复。
10. 为了展示肽特异性骨和骨髓，噬菌体洗脱从肾脏和肝脏进行了分析如上所述。在全部四轮比赛中有少量分布在这些器官（小于10％）的噬菌体。
11. 合成肽与甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸，丝氨酸，赖氨酸序列，与无素细胞和组织染色，以及在体内工作。

2。间质细胞培养成骨细胞分化实验

1. 克隆小鼠多能干骨髓基质（D1）在我们的实验室¹中分离的细胞系在体外实验中使用。细胞培养贝科必要的修改培养基，DMEM培养液，低血糖（GIBCO猫＃11885-084），辅以10％小牛血清（GIBCO猫＃16000-044），50毫克每毫升抗坏血酸钠（西格玛猫＃A7631 ），100 U / mL青霉素G和100毫克/毫升链霉素（GIBCO猫＃15140-122）。
2. 文化均保持在37 ° C直到在饱和湿度5％的CO ₂水套式孵化器和子培养细胞约90％汇合。
3. 细胞胰酶消化，离心来沉淀，计数，并在5X10 ³细胞/厘米²组织培养处理的塑料制品的浓度接种。

3。肽染色培养细胞和组织

1. D1或骨髓细胞接种于纤维连接蛋白或明胶涂层室以及幻灯片的DMEM和10％的胎儿24小时的牛血清。
2. 用PBS洗涤细胞。 30分钟，用4％多聚甲醛固定细胞/组织
3. 过量的醛被封锁10分钟使用0.5 M甘氨酸（pH值7.5）。
4. 5％BSA +亲和阻塞的解决方案除了阻止细胞表面的受体的内源性抗生物素蛋白和生物素是由1个小时，然后用5％BSA +生物素封闭液封闭1小时5分钟，PBS洗涤一次。
5. 100微米生物素L7和R1的肽分别加入30分钟井。
6. 细胞分别用PBS冲洗5分钟，每个1:1000稀释Alexa的面粉链霉和在黑暗中孵育30分钟三次。
7. 洗涤细胞和盖玻片vectashield安装媒体安装，并在荧光显微镜下观察。

4。碱性磷酸酶活性测定

1. 碱性磷酸酶彗星使用碱性磷酸酶试剂盒（BioRad公司）制造商的建议的单层olorimetric检测。
2. D1的细胞接种在5 × 10 ³细胞/ cm ^2的 6孔培养板的密度，并与R1肽治疗，ALP活性进行了量化，在4天，8，12，16和20。
3. 要准备的细胞裂解液，用PBS缓冲液洗细胞层三次，然后到PBS刮其次是超声和离心去除细胞碎片。
4. 然后混合等量的裂解液（100μL）与100μL新鲜配制的色度基板段，硝基苯磷酸盐，孵育在37 ° C为30分钟。
5. 100μL的0.2 N NaOH溶液中加入酶反应停止。 ALP活性测定在405 nm处用酶标仪（BIO - RAD）。
6. 用BioRad公司蛋白定量试剂盒，细胞裂解液中蛋白质含量测定AP的活动，然后表示nmol /分钟的/毫克蛋白质产生的第 - 硝基酚。
7. 根据制造商的规格（Sigma公司，公司）ALP活性。
8. ALP活性单位正常化毫克总蛋白含量与BCA法测定细胞裂解液（皮尔斯，罗克福德，IL）。

5。使用L7和R1的间质细胞分化

1. Subconfluent间质细胞（D1），增长约90％汇合，5NM L7和R1的肽治疗。
2. 0.5，2，6，24和48小时，收获细胞的RNA采用Qiagen公司的RNeasy试剂​​盒，使用制造商的指示。
3. 逆转录酶（RT）反应退火（37℃，10分钟）和第一链cDNA合成（42℃，30分钟），热灭活（95℃5分钟）。由此产生的基因储存冷冻（-70℃），直到通过实时PCR检测。
4. 实时PCR使用的QuantiTect SYBR绿色PCR试剂盒（QIAGEN）。反应进行25μLSYBR绿色套件预混，正向和反向引物如Runx2的，Osterix，骨钙素，骨涎蛋白，Wnt信号通路的基因，如b - catenin的骨特异性基因（300 nmol / L的）， LRP6，Wnt信号5A，7B，10B，DKK1和OPG和RANKL（见表1）。
5. cDNA样本3μL添加到RT反应未稀释的最终反应混合物。 96实时PCR格式包括六个重复的质粒DNA标准的10倍稀释。板井密封光学胶盖（BioRad公司），在低速离心（300克，5分钟），以确保完全混合。
6. 每个样品分析，至少一式两份，每份用iCycler仪（BioRad公司实验室，大力士，CA）。
7. PCR使用的协议涉及AmpliTaq黄金DNA聚合酶的激活，40个循环，随后在94 ° C为30秒，在72 ° C 30秒30秒，并扩展各自的退火温度。 PCR循环阈值，每个样品扫描（CT）计算荧光超过阈值限制的地步。沿着线性对数生长期在10到20个以上标准偏差（SDS）的平均背景荧光的荧光曲线的门槛限制是固定的。标准曲线方程计算回归分析与LOG10的cDNA相对于总RNA目前的平均CT。骨特异性基因的靶基因的相对表达归18S和B -肌动蛋白是Wnt信号通路的基因。

在体内制备的明胶海绵复合材料6 。

1. 使用无菌例程，明胶海绵缸（法玛西亚普强猫＃09-0353-01），8毫米长，直径3毫米，使用自行设计的仪器。
2. 手术前二十四小时，明胶海绵气瓶浸泡装有L7或R1肽（PBS中20微米）或PBS缓冲液无肽。明胶海绵气瓶被转移到无菌的12孔培养皿中，存放在-4 ° C过夜
3. 在手术时，在培养皿中的明胶海绵复合搬出冰箱和雪藏，直到手术。

7。骨缺损

1. 卫生系统在弗吉尼亚大学的动物护理和使用委员会前，正在执行的所有动物的程序获得批准。十人九月龄成年同源男性菲舍尔344大鼠（350-400克），氯胺酮（50克）每克体重和甲苯噻嗪（5克，每克体重）的混合腹腔麻醉。
2. 一个双边的手术方法是胫骨内侧方面。在这岁或以上的大鼠显示微不足道的横截面积增加，皮质骨面积，骨量，骨密度，轴向长度的anteromedia升方面的胫骨。测量3毫米宽8毫米长期使用气动毛刺（馆高速钻;吉玛）生理盐水冲洗下，创建一个大型的，长方形的unicortical缺陷。
3. 治疗骨缺损是用明胶海绵或不肽。所有植入支架，3毫米宽，8毫米的长度由1.5毫米的深度测量插入温柔攻。任何内部或外部肢体固定装置术后使用，并允许不受限制地走动的动物后立即手术。

8。组织学和形态计量学

大体形态和所采取的数字图像的骨再生进行了评估。

1. 安乐死大鼠的胫骨，3，5和12周进行量化损伤反应中产生的新骨量。
2. 收获胫骨缺损仔细检查后，被固定在10％中性缓冲福尔马林，RDO快速decalcifier脱钙72小时，然后常规处理和石蜡包埋，并分段纵向。
3. 骨再生进行了评估总值和光镜检查。
4. 十大动物被用于每个条件（即空的缺陷，明胶海绵单独和明胶海绵加R1的肽）。代表跨〜40的组织切片，每个8微米厚的8mm unicortical缺陷。的40部分，我们使用了至少6个部分，以量化的新骨量。
5. 所有的组织切片染色与苏木/伊红（H＆E），标签骨样基质。
6. 在显微镜下，所有的幻灯片进行了评估。

9。骨修复

概述

骨修复显然是肌肉骨骼组织再生领域的一个非常重要的考虑的领域。肽目标骨矫形外科实践中有显着的实用，特别是在使用多年，如果不是几十年，可以留置的protheses。仿生骨热带因素的属性，可以创建在组织工程领域的技术向前迈进一步，以及为骨修复手术。针对合成或天然聚合物因素的骨内可协助特异性细胞黏附，从而清除内源性细胞进行修复和再生的组织。另外一个目标是要建立，如果我们独特的骨针对biopanning体内噬菌体展示库中确定由肽将绑定到骨骼和骨髓细胞，并有调节成骨在体外和体内骨再生的潜力。

在我们的实验中，我们交付使用天然和合成聚合物基质和骨再生骨再生的组织学，生物化学，基因表达，显微CT，以生物力学的研究，以阐明肽活动的细节的大鼠股骨缺损肽。这种方法的进一步发展可导致目标的骨生物活性化合物的发现和发展，使可能通过修复机制，在细胞和分子水平生物学特征。

染色

与生物素标签，以确定具有约束力的和本地化的间质细胞合成肽。异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗生物素蛋白是用于本地化显微镜的肽在体外细胞生长的约束力。肽结合文化中的间质细胞，以及骨骼和骨髓在体外鼠标肋骨组织切片（ 图 1 ）。

Von Kossa染色的

一间质细胞（D1），是从骨髓中克隆和确定的肽在体外的成骨细胞的影响。细胞治疗与肽L7和R1，以确定在细胞形态和基因表达的变化。在第4天，细胞开始聚集，并随着时间的推移，形成结节，一个细胞的行为模式相似，在培养骨细胞（ 图2）扩大的聚合。

此外L7的肽或R1加强与冯科萨的文化细胞染色。细胞，然后用不同浓度高达16天中文化L7的肽或R1。经测定，5纳米肽在体外是最有效的。在对待文化与肽的碱性磷酸酶活性增加2倍和3.5倍之间。倍的增长，取决于肽的浓度和文化的治疗时间。

实时PCR

与L7和R1肽处理的细胞进行了分析，使用实时P训练班两个已知的成骨细胞转录因子（Osterix和Runx2的）和骨基质蛋白（骨涎蛋白，骨钙素和I型胶原）的基因表达。治疗与R1显示Osterix和Runx2的基因表达增加。型胶原的基因表达维持不变。与L7的处理表明了BSP和骨钙素基因表达的增加以及I型胶原蛋白基因的表达。这表明，这两个肽间质细胞培养成骨的发生和进展有关的基因的效果。

在体外细胞培养与肽R1和L7的治疗揭示了一个相关的骨形成间质细胞的合成代谢作用。护骨素以RANKL的比例在增加，显示在招聘骨细胞作为破骨细胞的骨吸收减少。肽细胞的治疗，也导致在与骨形成和减少的因素，抑制成骨基因的表达的增加。

组织学

要确定的骨量，我们暴露的骨片μLtraviolet光，从而产生自体荧光。 ²定量的目的，这提供了更大的的骨骼和非骨组织之间的对比。被拍到的部分使用尼康数码成像系统，在同一放大倍数（X10客观）明场和紫外灯（ 图3）尼康和紫外线。 Metavue成像软件（Molecular Devices公司）所产生的数字图像进行分析。我们选择了一个固定的，利益的矩形区域（ROI），包含8毫米unicortical缺陷。损伤部位始终代表手动放置在每个图像上的正确位置的框，这里面投资回报率。 H＆E染色阳性像素部分自动使用魔术棒工具，设置一种颜色宽容。这种宽容正是在H＆E -染色切片组织学外观与骨组织的绿色范围内，对应的突出像素的设置。每个部分的H＆E -积极像素总数录得。个别路段的像素数，平均每个胫骨样本，并在各治疗组之间的差异，基于这些平均数计算。所有样品的地区，然后进行比较的基础上的新皮质骨量（ 图4）。

骨中存在的部分进行了量化，以确定在单独比较，明胶海绵用明胶海绵+肽治疗骨缺损的修复。填充明胶海绵+ R1的肽的缺陷显示10金额最大的皮质修复，7和2倍，3，5，12周分别。明胶海绵的差异，在皮质骨修复+肽相比，单用明胶海绵在3和5周最为显着，表明该肽促进骨皮质的再生（图5）。

10。成骨肽的合成代谢作用

OPG / RANKL的比例大于RANKL / OPG的比例，这表明，肽对成骨细胞有直接的影响和调节骨吸收。

合成肽可能有较大的分子，如速度的准备，分子稳定，保质期长和潜在的治疗应用，的优势。试图调节骨质流失，并通过控制细胞因子和生长因子的再生，已经取得了重大进展。这些osteotropic肽，以现有的疗法，刺激骨的合成代谢和骨再生提供有吸引力的替代品。

图1。鼠标罗纹组织在体外的部分骨髓和骨肽结合。

图2（D1），间质细胞形成肽治疗后结节。

图3。使用成骨肽，L7和R1的骨修复的组织学。

图4。骨部分与H＆E染色，紫外光照射下，这会导致自体荧光。这提供了更大的骨骼和非骨组织之间的对比定量分析的目的。

图5。定量组织学部分骨皮质修复的金额最大的5个星期10倍的变化，7和3的2倍和5周表明，该肽促进骨皮质再生。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phage Display Peptide Library Kit-Ph.D-12	New England Biolabs	E8110S